溶葡萄球菌酶亲和层析研究

论文摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA）的出现并广泛传播,使得临床上葡萄球菌感染治疗变得十分困难。溶葡萄球菌酶（Lysostaphin）可切断细胞壁肽聚糖交联结构中gly五肽桥联,专一杀灭葡萄球菌属细菌,能特异高效地杀灭MRSA,并且不产生耐药性。有望成为治疗MRSA感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶并达到药用标准,本文对抗体亲和层析法获取高纯度的溶葡萄球菌酶进行了系统研究。首先在获得了高效表达溶葡萄球菌酶的基础上,通过单克隆抗体技术,成功制备了三株可高效稳定表达抗溶葡萄球菌酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株（A1G5A1、A2C1D10和L1F3）,然后依据ELISA检测结果选择其中效价较高的两种抗体（A1G5A1、A2C1D10）为配基,与CNBr活化的Sepharose4B偶联制成亲和层析柱用以纯化溶葡萄球菌酶,并对纯化过程中吸附和洗脱条件进行优化。结果显示用单克隆抗体（A1G5A1）作为配基的亲和层析柱在以含0.15M NaCl的0.05M Tris-HCl （pH 8.0）为结合条件,0.1M NaAC （pH4.0）为洗脱条件对溶葡萄球菌酶样品进行纯化时,可获得纯度大于95%的溶葡萄球菌酶,回收率可达到90%。但是纯化后的溶葡萄球菌酶SDS-PAGE分析显示在分子量17K Da处还是有杂条带存在,经Western blotting检验,纯化后的电泳杂条带同样成阳性。为了除去这样的杂条带,利用Antheprot对溶葡萄球菌进行了抗原性表位分析并合成了溶葡萄球菌酶分子N端3-13位的表位（THEHSAQWLN）,然后利用戊二醛双功能试剂将人工合成的多肽成功地与KLH进行偶联,免疫新西兰兔制备了抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽的抗体（LTN1）,用此抗体制备的免疫亲和柱对单抗（A1G5A1）纯化后的溶葡萄球菌酶进行再纯化,最终获得了纯度达到98%以上的溶葡萄球菌酶,而且纯化后的溶葡萄球菌酶仍保持良好的酶活性。本文对溶葡萄球菌酶免疫亲和层析的系统研究为获得高纯度溶葡萄球菌酶提供了一种很好的办法,可以应用到高纯度重组溶葡萄球菌酶的生产上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 溶葡萄球菌酶的重要作用
• 1.2 溶葡萄球菌酶的作用机理
• 1.3 溶葡萄球菌酶的理化性质
• 1.4 溶葡萄球菌酶纯化进展
• 参考文献
• 第二章 溶葡萄球菌酶单克隆抗体的制备
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 免疫动物结果
• 2.2.2 细胞融合及初筛结果
• 2.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 2.2.4 腹水收集及纯化结果
• 2.2.5 单克隆抗体的鉴定
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 第三章 单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 抗体偶联效率测定
• 3.2.2 溶葡萄球菌酶亲和层析
• 3.2.3 SDS-PAGE 电泳
• 3.2.4 高效液相色谱（HPLC）纯度分析
• 3.2.5 溶葡萄球菌酶活性鉴定
• 3.2.6 免疫亲和柱的稳定性和可重复性检测
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 第四章 重组溶葡萄球菌酶抗体亲和层析法的改进
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 抗原肽的设计与合成
• 4.2.2 多肽抗体的制备与效价
• 4.2.3 多肽抗体的纯化
• 4.2.4 多肽抗体特异性的鉴定
• 4.2.5 SDS-PAGE 电泳
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 已发表文章
• 致谢