论文摘要
茁霉多糖（pullulan）是由出芽短梗霉菌株（Aureobasidium pullulans）生产的胞外多糖。该糖无色无味、无毒,对人体无任何副作用,具有优良的水溶性、阻隔氧气性、成膜性、成纤性、粘结性和自然降解性等许多独特的物理化学和生物特性,可被广泛应用到食品、医药、化妆品、烟草和农业等领域,并且可以被微生物降解,不会对环境造成污染,是一种具有极大经济价值和开发潜力的多功能新型生物材料。在国外,茁霉多糖已工业化生产,但国内尚无茁霉多糖产品,关键是没有高产菌,因此获取茁霉多糖高产菌是工业化生产的先决条件。近年来原生质体融合已成功应用于多种微生物,但尚未用于出芽短梗霉。本研究旨在采用双亲灭活出短梗霉原生质体融合法获取茁霉多糖高产菌,为茁霉多糖工业化生产提供了具有应用价值的菌株。同时对变异株的发酵条件优化方面进行了论述。本研究首先以本研究室保藏的两株菌种——出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）P和经过紫外诱变得到的产色素含量相对较少的菌株UV1为出发菌株,制备原生质体。分别取经过培养24小时的菌体,用无菌水洗涤1～2次,并调菌体浓度为108个/mL。分别取2mL菌6000r/min离心收集菌体,加入等体积β-巯基乙醇,在37℃处理30min。将预处理好的菌体经6000r/min离心,收集菌体,分别加入蜗牛酶、纤维素酶混合液（蜗牛酶∶纤维素酶=1∶1）在温度为37℃,处理时间为1小时,用悬滴法经复红或稀释10倍的结晶紫染色,取样观察原生质体的形成情况。此时原生质体形成率高达100%。在RM1、RM2再生培养基上原生质体的再生率较高,尤其在富含甘露醇的RM1培养基上,再生率达64.6%,由此可以看出,本研究方法不仅提高了原生质体形成率,同时也提高了其再生率。其次进行双亲灭活原生质体融合研究:取制备好的UV1原生质体悬浮液2mL置于小离心管中,于60℃水浴中保温20min,可使原质体灭活率达100%。另取制备好的出芽短梗霉P的原生质体悬浮液4mL在30W紫外灯下,照射距离30cm条件下,磁力搅拌下照射3min,原生质体灭活率达100%。将上述制备好的灭活双亲悬浮液混合,6000r/min离心10min,弃去上清液,加入40%PEG6000促融,同时加入新生磷酸钙溶液,轻摇匀后在37℃恒温水浴中保温5～10 min,6000r/min离心10min,弃上清液,沉淀加入0.6mol/L的KCl洗去原生质体上的PEG6000,离心收集原生质体,加入0.6mol/L的KCl,稀释后涂布在RM1平板上。灭活的双亲原生质体只有通过融合后致死损伤得到互补才能形成融合子,因此,由紫外、热灭活的原理可以推出在再生培养基上生长出的菌体即为融合株。将所检出的融合子在基本培养基上连续传10代,保存传代稳定的融合子。经融合子的初筛、复筛,从融合株中筛选出一株茁霉多糖高产菌株RH。最后对融合菌株RH进行发酵条件优化研究,首先采用单因素筛选法设计从碳源、氮源、无机盐、种子质量、温度、pH、发酵时间等可以用于出芽短梗霉发酵生产的营养基质和发酵条件中筛选影响茁霉多糖产量的关键因素。然后采用正交试验分别对营养基质和发酵条件中各因素之间关系进行评价,得到最佳营养基质和发酵条件,并用SPSS统计软件进行结果分析。最后确立高产茁霉多糖菌株RH培养条件为最适碳源是蔗糖,初始蔗糖浓度为10%;最适氮源为酵母膏、（NH4）2SO4,初始浓度为0.2%酵母膏与0.04%（NH4）2SO4;最适无机盐是:初始浓度为0.01%的MgSO4·7H2O、初始浓度为0.2%的KH2PO4和初始浓度为0.2%的NaCl;最佳培养温度为28℃;发酵时间（发酵周期）为120h;初始培养基pH为6.0;接种量为5%。经上述条件培养后发酵液中茁霉多糖含量为73.6g/L。较出发菌株提高了9倍。因此双亲灭活原生质体融合法选育茁霉多糖高产菌株是值得推广的一种选育方法。