青霉TS67的诱变选育及抗真菌作用机理研究

论文摘要

海洋真菌TS67是从渤海海域分离获得的一株青霉菌株,该菌株能产生抗植物病原真菌病害的次级代谢产物,对多种植物病原真菌具有不同程度的抗性,抗菌谱较广。本文针对玉蜀黍平脐蠕孢菌（Bipolaris maydis）和大豆尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）这两种植物病原真菌对青霉TS67从高产菌株的选育,活性物质的理化性质及类型分析,抗真菌机制等方面进行了系列研究。（1）为了提高青霉TS67的抗真菌活性,对其分生孢子进行物理和化学诱变处理,通过平板对峙法和管碟法,获得3株高产且传代稳定性较好的突变菌株Z10,W8,UD3,其抑菌活性分别比原始菌株提高了41.9%,45.6%,31.3%。（2）初步探讨了青霉TS67菌株发酵活性产物对玉蜀黍平脐蠕孢菌和大豆尖孢镰刀菌的抑制作用,结果表明:用50%发酵液处理120h后,对两种病原菌菌丝生长的抑制率分别为77.78%,70.30%,孢子产生抑制率分别达58.8%,73.5%;50%发酵液处理孢子12h,孢子萌发抑制率分别达78.3%,62.0%。电镜实验表明:经抗菌活性物质处理后的菌丝呈现菌体表面瘤状畸形、菌丝生长顶端不规则膨胀、菌丝体内部发生原生质浓缩等现象,初步推测该抗菌活性物质能够作用于病原真菌细胞壁。理化性质及分离提取实验证实青霉TS67菌株产生的抗真菌活性物质属于蛋白类物质。（3）采用3,5-二硝基水杨酸法检测青霉TS67发酵液中几丁质酶和β-葡聚糖酶活力,结果表明几丁质酶和β-葡聚糖酶的比活力分别为2.2 U/mg 13.1 U/mg。同时对β-葡聚糖酶酶学特性研究,结果表明该酶在弱酸,60℃条件下较稳定,酶反应的最适pH5.0,最适反应温度55℃,金属离子K+,Mg2+,Ca2+,Al3+,Mn2+,Fe2+,Fe3+,Zn2+对该酶有的激活作用,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的分子量约为62KDa。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1 农用抗生素的研究概况
• 1.1 农用抗生素开发的意义
• 1.2 农用抗生素发展历史
• 1.3 开发农用抗生素存在的主要问题
• 2 诱变在产抗生素微生物育种中的应用
• 2.1 提高产量
• 2.2 减少杂质,提高纯度
• 2.3 改进发酵工艺
• 2.4 产生新抗生素
• 3 抗真菌抗生素作用机理研究进展
• 3.1 作用于病原真菌细胞壁
• 3.1.1 作用于几丁质合成酶影响几丁质的合成
• 3.1.2 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂
• 3.1.3 作用于甘露聚糖和甘露聚糖-蛋白质复合物
• 3.2 作用于菌体细胞膜
• 3.2.1 作用于麦角甾醇（ergosterol）
• 3.2.2 鞘磷脂类
• +-ATP酶和膜离子通道'>3.2.3 真菌胞浆膜H⁺-ATP酶和膜离子通道
• 3.3 作用于蛋白质合成系统
• 3.3.1 作用于核糖体
• 3.3.2 抑制真菌蛋白质延长因子
• 3.4 作用于核酸代谢,阻碍遗传信息的复制
• 3.5 作用于能量代谢系统
• 3.5.1 抑制线粒体ATP合成酶
• 3.5.2 抑制电子传递链
• 3.5.3 阻碍糖代谢
• 4 本课题的选题依据和研究意义
• 第二章 青霉TS67的诱变育种
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要实验设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 青霉TS67的诱变处理
• 1.2.2 初筛
• 1.2.3 复筛
• 1.2.4 传代稳定性
• 2 结果与讨论
• 2.1 青霉TS67的诱变选育
• 2.1.1 紫外线诱变
• 2.1.2 微波诱变
• 2.1.3 亚硝酸及其复合诱变
• 2.1.4 DES及其复合诱变
• 2.1.5 传代稳定性实验
• 2.1.6 不同诱变方案诱变效果的比较
• 3 结论
• 第三章 青霉TS67抗菌作用机理及抗菌物质的性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 青霉TS67发酵液的抑真菌作用
• 1.2.2 发酵液中活性物质的稳定性
• 1.2.3 发酵液中活性物质的粗分离
• 2 结果与讨论
• 2.1 对病原真菌的抑制作用
• 2.1.1 对菌丝生长的抑制作用
• 2.1.2 对孢子产生的抑制作用
• 2.1.3 对孢子萌发的抑制作用
• 2.1.4 对菌丝形态的影响
• 2.2 发酵液中活性物质的稳定性
• 2.2.1 酸碱稳定性
• 2.2.2 热稳定性
• 2.2.3 光照对发酵液抑菌活性的影响
• 2.2.4 有机溶剂对发酵液中活性物质的影响
• 2.2.5 双水相萃取稳定性
• 2.2.6 发酵液贮藏稳定性
• 2.3 发酵液中活性物质的粗分离
• 2.3.1 透析
• 2.3.2 葡聚糖SephadexG-75柱层析
• 3 结论
• 第四章 青霉TS67胞外蛋白酶及其酶学特性
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种及培养基
• 1.1.2 主要设备和药品
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 TS67胞外几丁质酶活的测定
• 1.2.2 TS67胞外β-葡聚糖酶酶活的测定
• 1.2.3 β-葡聚糖酶的酶学特性研究
• 2 结果与讨论
• 2.1 TS67胞外几丁质酶活的测定
• 2.2 TS67胞外β-葡聚糖酶活的测定
• 2.3 β-葡聚糖酶的酶学特性研究
• 2.3.1 温度对酶活性的影响及其热稳定性
• 2.3.2 最适pH值及酸碱稳定性
• 2.3.3 金属离子对酶活力的影响
• 2.3.4 酶的比活力的测定
• 2.3.5 β-葡聚糖酶蛋白分子量测定
• 3 结论
• 第五章 结论与进一步工作设想
• 参考文献
• 致谢