论文摘要
本研究选择4个氨基糖苷类药物耐药基因（aph（3′）-Ⅱa、aac（6′）-Ⅰb、ant（3″）-Ⅰa、aac（3）-Ⅱa）作为扩增目的基因，根据多重PCR引物设计原则，设计了4对特异性四重PCR引物，应用单基因PCR扩增技术筛选出各个耐药基因的阳性菌株，并进行序列测定。测序结果与GenBank中的相应耐药基因序列比较，同源性依次为aph（3′）-Ⅱa（99.4％）、aac（6′）-Ⅰb（99.3％）、ant（3″）-Ⅰa（99.2％）、aac（3）-Ⅱa（95.3％），证明了设计引物的正确性和特异性。阳性菌株（E99，107）做为本方法阳性对照。在确定了4个单基因PCR扩增体系各个参数的最佳值和可变动范围的基础上，进行了4重PCR扩增体系的探索与优化，其中包括Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度等组份浓度的优化，退火温度、循环次数等循环参数的优化。试验结果显示，成功建立了氨基糖苷类药物耐药基因的4重PCR检测方法，最佳反应体系如下：10×PCR Buffer 5μl，MgCl2（25 mmol／L）5μl，dNTP（2.5 mmol／L）4μl，模板5μl（菌液浓度相当于McFarland No 1.0），Taq DNA聚合酶（2.5 U／μl）0.3μl，上下游引物（25 mmol／L）各添加：aph（3′）-Ⅱa（0.5μl）、aac（3）-Ⅱa（0.9μl）、aac（6′）-Ⅰb（0.8μl）、ant（3″）-Ⅰa（1.8μl），最后补充灭菌双蒸水至50μl。最佳扩增反应参数为：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，54℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32个循环；最后72℃延伸10 min。4℃保存。本研究还对PCR模板制备方法进行了筛选和优化，通过添加60％甘油，保证了模板和Taq酶的稳定性。采用的待检细菌模板制备方法不需经过繁琐的细菌DNA提取过程，只需对细菌培养物进行两次离心即可进行测定。对试剂盒特异性、敏感性、重复性和保质期进行了系统的检测试验。检测结果表明：本试剂盒具有很强的特异性，只能特异性扩增出待检测的耐药基因；具有很高的灵敏度（3.6×104CFU／mL）；并且性能稳定，有很好的批内和批间重复性（100％）；试剂盒在-20℃下的保质期为4个月。应用本检测试剂盒和传统药敏试验方法（K—B法）对30株细菌的耐药性进行检测，比较两者检测过程和检测结果。结果表明，两者检出结果的符合率为90％，本试剂盒还具有灵敏度高、操作简便，检测时间短等特点。应用该试剂盒对我国24个省45个规模化养殖场484株分离菌和四川地区30只大熊猫59株肠道分离菌进行了检测。结果表明：各个省市的分离菌检出率存在很大的差异。其中，aph（3′）-Ⅱa基因的最高检出率为80％（北京）；aac（6′）-Ⅰb基因的最高检出率为26.7％（浙江）；ant（3″）-Ⅰa基因的最高检出率为73.3％（山东）；aac（3）-Ⅱa基因的最高检出率为66.7％（甘肃）。4个耐药基因的平均检出率分别为：aph（3′）-Ⅱa（46.1％）、aac（6′）-Ⅰb（11.6％）、ant（3″）-Ⅰa（50.4％）、aac（3）-Ⅱa（42.8％）。在59株大熊猫分离菌中，aph（3′）-Ⅱa的检出率最高（10.17％），其次为ant（3″）-Ⅰa基因（5.08％）和aac（3）-Ⅱa基因为（1.69％），而没有扩增出aac（6′）-Ⅰb基因。本研究率先在国内外建立了氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测试剂盒，并应用该试剂盒对543株细菌进行了耐药基因的检测，为氨基糖苷类耐药基因的检测提供了一种快速、便捷、准确的方法。