基于甲基化特异性引物和SAGE的高通量DNA甲基化定量检测方法研究

论文摘要

遗传与变异是生物界普遍存在的一种生命现象。经典遗传学告诉我们若生物遗传物质相同,生物性状也应该一样,但是事实往往并非如此!没有遗传物质的变化,生物性状却可以在亲代和子代间传递,涉及的内在机制就是在经典遗传本质之外的表观遗传（Epigenetics）。所谓表观遗传,是指当DNA序列没有任何改变时,基因的功能或者生物性状的变化却可以通过有丝分裂和/或减数分裂进行传递。表观遗传的本质与基因组DNA甲基化和组蛋白的修饰（甲基化和乙酰化）存在密切关系。现有研究表明DNA甲基化状态改变是比基因突变更早的生物事件。真核生物基因组DNA甲基化与基因表达、肿瘤发生、基因印迹、X染色体失活和染色体结构维持有密切关系。核心机制在于基因表达调节位点的高甲基化可以抑制基因的表达或者使基因失活,因此开展真核生物基因组甲基化研究具有重要意义!真核生物基因组DNA甲基化主要发生在CG二核苷酸（CpG）的胞嘧啶碱基5位碳环上,简称为5’-mC。目前发现真核生物基因组内每个CpG位点的甲基化不是完全甲基化和无甲基化这两种简单的情况,不同生物、不同组织、不同器官的基因组DNA每个甲基化潜在位点都有其固有的或者说是相对正常的甲基化水平,每个位点甲基化水平可以用百分比来表示。而这种相对正常的甲基化水平对于维护这些细胞群相对正常的生理和生化功能具有非常重要的意义。了解真核生物体内不同生物、不同组织、不同器官的基因组DNA每个CpG位点甲基化固有水平,是开展各种病理状态和机体稳态失衡的表遗传相关机制的前提。开展DNA甲基化研究的关键是了解目标CpG甲基化水平变异位点（methylation variation positions）与各种生理和病理事件的相互关系。就我们人类来说,如果能够建立某种正常组织基因组所有CpG位点固有甲基化水平的图谱,那么对于目前的各种肿瘤等的表观遗传机制研究来说将是根本性的进步。目前一项针对绘制人类所有不同组织、不同器官的基因组每个CpG位点甲基化固有水平图谱的计划即人类表观遗传研究计划（Human Epigenetic Project, HEP）已经于2003年开始启动。HEP的主要目的是绘制出与目前人类基因组图谱相似的“甲基化变异图谱”,即甲基化变异位点（methylation variable positions, MVPs）图谱,MVPs对阐明一些重要疾病的发病机理和疾病诊断具有重要意义。正如人类基因组计划的完成依赖于高效技术的开发一样, HEP计划能否实现的关键就在于高通量DNA甲基化定量检测方法的使用与否。目前开展DNA甲基化研究困难较大,主要的原因就在于DNA甲基化的检测比较困难。到目前为止,虽然有很多方法报道,但是一般还只限于定性检测（如甲基化特异性PCR法）,一个或数个位点的定量检测等（MALDI质谱定量检测技术）。所以开展DNA甲基化研究真正的限制在于检测方法的局限。目前可使用的甲基化检测技术虽然很多,但是这些方法一般来说都有一些固有的缺陷如单次检测位点有限,需要使用位点特异性引物,需要较高的硬件支持等。因此,相对于比HGP大数倍的工作量,建立新的高通量的甲基化CpG位点定量检测方法对人类表观遗传研究特别是HEP来说是一个亟待解决的难题。SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变。基于SAGE技术的启发,我们将亚硫酸氢钠处理和甲基化特异性引物延伸结合起来,创立了一种全新的基于甲基化特异性引物（methylation-specific primers, MSP）和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测方法,简称为MSP-SAGE,以应用于基因组甲基化定量分析。MSP-SAGE的原理如下:首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为U,而甲基化的CpG不变。将处理和未处理的DNA变性成单链,用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行特异延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;再次变性后利用随机引物将延伸所得的单链产物补成带有一个磷酸基团的平末端双链;再将其与一个带有平端的人工接头Linker1（含Mme I限制性内切酶识别位点TCCPuAC（N）20/18）进行连接,用Mme I酶切后再与连接子Linker2连接起来,从而构建成两端具有已知引物序列和中间带有未知序列的双链模板并进行随后的PCR扩增;对PCR产物进行酶切,分离纯化对应的17bp的未知标签片断Tags;将这些Tags串联起来形成串联子,将串联子克隆测序,一次即可得到许多Tag的序列信息和数量信息。根据两组Tags的序列信息可以对甲基化CpG进行定位,根据两组Tags的数量信息可以计算出该位点的甲基化定量信息（%）。本研究分为三个部分:第一部分、DNA甲基化标准品的研制目的:制备DNA定量甲基化标准系列应用于研制DNA甲基化定量检测新方法和DNA甲基化样本的实际检测。方法:通过BLAST搜索,确定人工合成特异的DNA单链序列并将其杂交成双链DNA标准序列,然后用DNA甲基化酶M.SssⅠ将标准DNA序列完全甲基化,对未甲基化DNA序列进行降解后,回收完全甲基化序列并利用亚硫酸氢钠（HSO3-）基因组测序法检测其甲基化的效果,最后配制不同甲基化水平的DNA甲基化标准品。结论:HpaⅡ酶切结果显示DNA序列甲基化处理效果较好。亚硫酸氢钠基因组测序法克隆测序结果也证明回收的DNA甲基化双链处于完全甲基化状态。结果: DNA甲基化系列标准品研制成功,并可应用于下一步的DNA甲基化方法学研究。第二部分、基于甲基化特异性引物和SAGE的DNA甲基化高通量检测方法目的:创立一种全新的基于甲基化特异性引物和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测方法（MSP-SAGE）,以应用于高通量DNA甲基化的定量检测。方法:MSP-SAGE的设计综合利用了SAGE技术、甲基化特异性引物、核酸内切酶MmeⅠ、生物素磁珠和亚硫酸氢钠处理技术的优点。首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为U,而甲基化的CpG不变。将处理和未处理的DNA变性成单链,用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行特异延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;再次变性后利用随机引物将延伸所得的单链产物补成带有一个磷酸基团的平末端双链;再将其与一个带有平端的人工接头Linker1 （含Mme I限制性内切酶识别位点TCCPuAC（N）20/18）进行连接,用Mme I酶切后再与连接子Linker2连接起来,从而构建成两端具有已知引物序列和中间带有未知序列的双链模板并进行随后的PCR扩增;对PCR产物进行酶切,分离纯化对应的17bp的未知标签片断Tags;将这些Tags串联起来形成串联子并进行克隆测序,一次即可得到许多Tag的序列信息和数量信息。将来自于未处理组的某一CpG位点的序列出现的次数定义为[Tags]A,其相应的处理组的该CpG位点的序列出现的次数定义为[Tags]B,将标准系列的实际甲基化水平和[Tags]B/[Tags]A之间建立线性回归方程,得出回归系数k。根据测序结果计算出每一位点的[Tags]B/[Tags]A比值,依据公式:ML（%）=[Tags]B/[Tags]A×1/k×100,就可以计算出该位点的甲基化定量信息。结果:MSP-SAGE具有良好的线性,基于标准系列的[Tags]B/[Tags]A与其实际甲基化水平的标准曲线方程为Y=1.455x（R2=0.984,P<0.01）。甲基化水平为80%的DNA甲基化标准样品,其对应的[Tags]B/[Tags]A为137/119,计算所得的甲基化水平为79.1%。MSP-SAGE的回收率在95%到110%之间,精确度位于4.2%和10.5%,检测限在3%左右。另外还对MSP-SAGE的实验条件进行了优化。DNA的适宜起始模板量应该不低于6×107个DNA分子,MSP-SAGE的单次检测通量至少可以达到24个CpG位点,产生MSP-SAGE稳定检测结果所需克隆数目至少为被检测CpG位点的两倍。结论:相对于目前的检测方法,MSP-SAGE具有很多优点,是一种很有应用前途的高通量DNA甲基化定量检测方法。第三部分、利用MSP-SAGE检测p16基因CpG岛人工样品目的:检验MSP-SAGE用于高通量甲基化定量检测的实际效果。方法:以人类p16基因CpG岛区域为目标,人工扩增构建出甲基化水平已知的人类基因组人工样品作为检测对象,同时利用MSP-SAGE和基因组测序法对人工样品的DNA甲基化进行定量检测,并对结果进行横向比较。结果:各次检测均具有良好的线性,DNA甲基化人工样品MSP-SAGE和亚硫酸氢钠测序法检测结果差异无统计学意义,两种方法的总体一致性可以达到98.51%。结论:MSP-SAGE是一种高效实用的高通量DNA甲基化定量检测方法,可以应用于真核生物基因组DNA甲基化的高通量检测。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 DNA 甲基化标准品的研制
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 基于甲基化特异性引物和SAGE 的DNA 甲基化高通量检测方法研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 利用MSP-SAGE 检测p16 基因CpG 岛人工样品
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢