新疆哈密市食品药品检验所/黑龙江省哈尔滨市食品药品行政执法局买买提·艾买提王丽霞摘要目的：对柏子养心丸进行微生物限度检查法适用性试验的研究。方法：按照2015版《中国药典》四部通则的要求检查，通过回收率的比较来确定适宜的检查方法。结果：需氧菌总数取1:100的供试液采用薄膜过滤法，稀释剂用量为100ml，冲洗液用量为500ml，稀释剂和冲洗液均为0.1%无菌蛋白胨水溶液；霉菌和酵母菌总数取1:10的供试液采用平皿倾注法，控制菌大肠埃希菌培养基用量为100ml，沙门菌培养基用量为100ml，耐胆盐革兰阴性菌培养基用量为10ml。结论：建立了柏子养心丸的微生物限度检查法，该方法有效可行。
关键词：柏子养心丸、微生物限度检查法、2015版《中国药典》
［中图分类号］R285.5［文献标识码］A[文章编号]1439-3768-（2019）-05-LG
StudyontheApplicabilityTestofMicrobialLimitsTestofBaiziYangxinPill
Maimaiti·Aimaiti1，Wanglixia2(1.XinjiangHamiInstituteforFoodandDrugControl，2.HarbinFoodandDrugAdministiveLawEnforcementBureau)
ABSTRACT:OBJECTIVE：TostudytheapplicabilitytestofmicrobiallimitstestofBaiziYangxinPilll.Method:ThetestwascarriedoutaccordingtoChinesePharmacopeia(2015edition,volumeIV),suitablemethodwasconfirmedbycomparingrecoveryrate.Results：ThemethodadoptedforTAMCoftheproductismembranefiltrationwitha1in100dilutionofthesample,100mldiluentand500mlrinsingdiluent,diluentandwashingfluidwas0.1%peptonewatersolution;themethodforTYMCisplatepouringmethodwitha1in10dilutionofthesample;thedosageofE.coliculturewas100ml,thedosageofsalmonellawas200ml;theCultureandconsumptionofBilesaltresistantgram-negativebacteriawas10ml.Conclusion:ThemicrobiallimitstestofBaiziYangxinPillwasestablished,themethodwaseffectiveandfeasible.
Keywords:BaiziYangxinPill,microbiallimitstest,Ch.P2015Edition
本品含有柏子仁、党参、炙黄芪、川芎、当归、茯苓等十三味中药材，朱砂水飞成极细粉，其余柏子仁等十二味粉碎成细粉，过筛，混合，加适量炼蜜和水制成水蜜丸[1]。具有益气补血养心安神之功效，临床用于心气虚寒、心悸易惊、失眠多梦、健忘等症[2]。根据柏子养心丸的处方和工艺可知其成分含有生药原粉，按照2015版《中国药典》四部附录通则1107的规定，需氧菌总数每克不得大于3×104cfu，霉菌和酵母菌总数不得大于102cfu，大肠埃希菌每克不得检出，沙门菌每10克不得检出，耐胆盐革兰阴性菌每克应小于102cfu[3]。参照《黑龙江省药品微生物检验方法汇编》中柏子养心丸的微生物限度检查法并结合其限度要求，按照2015版《中国药典》四部附录通则1105、1106的要求对柏子养心丸微生物限度检查法适用性试验进行研究。
1仪器与材料
1.1仪器
SW-CJ-2FD超净台（AIRTECH）；PL202-S电子天平(METTLER)；HTY-761匀浆仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)；Hfsafe-1200A2生物安全柜(HealForce)；DH5000A型电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌器（Panasonic）；MJPS-250培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；VORTEX3涡旋混合器（IKA）。
1.2滤器
微生物限度检验用薄膜过滤器（型号：NS01-75D2）批号：20150526由北京牛牛基因技术有限公司提供。
1.3培养基及试剂
胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：5294853）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：5215824）由BD公司提供；沙氏葡萄糖肉汤（批号：1409182）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：140919）、麦康凯液体培养基（批号：140928）、麦康凯琼脂培养基（批号：140926）、RV沙门增菌液体培养基（批号：140729）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：140822）、肠道菌增菌肉汤培养基（批号：140916）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养（批号：140923）均由北京三药科技开发公司提供；蛋白胨（批号：20161212）由北京陆桥技术股份有限公司。培养基的适用性检查均符合《中国药典》2015年版四部附录通则的规定[4]。
1.4菌株
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]、乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC（B）50094]、大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]均由中国食品药品检定研究院提供，且传代次数均不超过5代。
1.5试验样品本试验样品由哈药集团世一堂制药厂提供，批号1405113。
2方法和结果
2.1微生物计数法适用性试验
2.1.1菌液制备
将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24小时后，分别取相应新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5、10-5、10-3稀释级和10-7、10-7、10-5稀释级，每株菌分别制成每1ml含菌量不大于104和102cfu的两种浓度的菌悬液；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，23℃培养24小时后，取新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-3、10-5，制成每1ml含菌量不大于、104、102cfu的菌悬液；取黑曲霉斜面1支，加入5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2、10-4，制成每1ml含菌量不大于104、102cfu的孢子悬液。
2.1.2供试液的制备
取本品10g，加入胰酪大豆胨液体培养基100ml，用匀浆仪分散混匀，作为1:10的供试液。取1:10供试液10ml，加入胰酪大豆胨液体培养基90ml，作为1:100的供试液。
2.1.3接种和稀释
2.1.3.1需氧菌总数试验组方法一：取2.1.2项下的1:100供试液9.9ml，加至灭菌的空试管中，平行制备5份，分别加入2.1.1项下的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌菌液各0.1ml，充分混匀后各取1ml（使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu），加至100ml稀释剂中，采用薄膜过滤法过滤，冲洗液用量为每膜500ml，过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，置33℃培养箱中，培养2天，计需氧菌总数。稀释剂和冲洗液均为0.1%无菌蛋白胨水溶液。方法二：取2.1.2项下的1:100供试液1ml，加至100ml稀释剂中，平行制备5份，采用薄膜过滤法过滤，冲洗液用量为每膜500ml，并在最后一次冲洗液中分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌菌液1ml（使每1ml菌液中含菌量不大于100cfu），过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，置33℃培养箱中，培养2天，计需氧菌总数。稀释剂和冲洗液均为0.1%无菌蛋白胨水溶液。
2.1.3.2霉菌和酵母菌总数试验组取2.1.2项下的1:10供试液9.9ml，加至灭菌的空试管中，平行制备2份，分别加入2.1.1项下白色念珠菌、黑曲霉试验菌菌液各0.1ml，充分混匀后各取1ml（使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu），加至直径90mm的无菌平皿中，每一试验菌株平行制备2个平皿，分别加入温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基。
2.1.3.3对照组
供试品对照组，取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作；菌液对照组，取不含中和剂或灭活剂的相应稀释液替代供试液，同试验组操作；阴性对照组，以稀释液代替供试液及试验菌液，同试验组操作。
2.1.3.4供试品中微生物的回收
菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数×100%，计算回收率，结果见表1、表2。
表1需氧菌总数计数方法适用性试验回收率（%）
方法
序号需氧菌总数
金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌一103.1104.339.292.290.0二96.9100.086.598.094.0
表2霉菌及酵母菌总数计数方法适用性试验回收率（%）方法霉菌及酵母菌总数（平皿倾注法）白色念珠菌黑曲霉菌1:1097.593.9
2.2控制菌检查法适用性试验2.2.1菌液制备
取大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌适量，接种于胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24小时后，取新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7，制成每1ml中含菌量不大于100cfu的菌悬液。
2.2.2大肠埃希菌
取2.1.2项下1:10供试液10ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，再加入2.2.1项下的大肠埃希菌菌液1ml，加菌量不大于100cfu/ml。
2.2.3沙门菌
取供试品10g，加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，用匀浆仪分散混匀，再加入2.2.1项下的乙型副伤寒沙门菌菌液1ml，加菌量不大于100cfu/ml。
2.2.4耐胆盐革兰阴性菌
取2.1.2项下1:10供试液10ml，置25℃预培养2小时后，取上述供试液的预培养物1ml（相当于0.1g供试品）2份，分别接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，分别加入2.2.1项下大肠埃希菌菌液1ml和铜绿假单胞菌菌液1ml，加菌量均不大于100cfu/ml。
2.2.5阴性对照组
以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，结果见表3。
表3控制菌检查法适用性试验结果表
大肠埃希菌沙门菌耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌试验组++++阴性对照组----
注：“+”表示该培养基有菌生长，“-”表示该培养基无菌生长2.3结果分析
柏子养心丸按照《中国药典》2010版的要求，验证方法主要有三种：方法一，细菌计数采用离心沉淀-培养基稀释法（0.2ml/皿），霉菌及酵母菌计数采用平皿法，控制菌大肠埃希菌和大肠菌群均采用常规法；方法二，细菌计数采用平皿法，霉菌及酵母菌计数采用平皿法，控制菌大肠埃希菌和大肠菌群均采用常规法[5]。按照2015版《中国药典》相关要求进行适用性试验时，试验证明柏子养心丸对枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌性，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉无抑菌活性。表1表明，需氧菌总数取1:100的供试液采用薄膜过滤法进行检查，稀释液用量为100ml，冲洗液用量为500ml，稀释液和冲洗液均为0.1%无菌蛋白胨水溶液我；表2表明霉菌和酵母菌总数取1:10的供试液采用平皿倾注法进行检查；表3表明大肠埃希菌，取1:10供试液10ml，加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查；沙门菌，取供试品10g，加至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查；耐胆盐革兰阴性菌，取1:10供试液依法处理后，取预培养物，加至10ml肠道菌增菌液体培养基中，依法检查。
3讨论
《中华人民共和国药典》2015版微生物限度方法适用性培养基、加菌方式、培养条件均发生了很大的变化，但2010版的方法学验证材料仍然具有一定的价值，它可作为2015版方法适用性试验的参考。但由于加菌方式改变，一些品种的微生物限度检查方法改变较大，说明菌液和药液先混匀再进行验证的方式更直接真实地反映出药品对菌液的抑制能力。这时可以选择中和、稀释或薄膜过滤法消除抑菌性。但是柏子养心丸对枯草芽孢杆菌抑菌性极强，采用稀释后接种试验菌再联合薄膜过滤法的方式亦无法消除其抑菌性，最终只能选择先进行稀释和薄膜过滤法联合处理供试品，再接种试验菌进行方法适用性试验，枯草芽孢杆菌的回收率才能够满足要求，即大于50%。
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）.2015年版[S]1164-1165.
[2]张三平.柏子养心丸的质量控制研究[J].中成药2006,28（2）283-285
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）.2015年版[S]149-151.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）.2015年版[S]140-149.
[5]杨利红，欧阳丽影，王瑛等.黑龙江省药品微生物检验方法汇编[M].黑龙江人民出版社.25-23.
document.getElementById('cnt-ad').style.display='none';