转基因水稻对土壤微生物群落结构及功能的影响

论文摘要

随着转基因植物商品化进程的加快,对其进行生态风险性评价日益引起学者的重视。目前对转基因作物生态风险性评价的研究对象主要集中在玉米、棉花和马铃薯等旱田作物。本研究在省农科院转基因水稻中试与产业化基地寿山和吴凤大田条件下,以转Bt基因水稻及其非转基因亲本为材料,采用平板菌落计数法、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和Biolog法,探讨了转基因水稻对土壤微生物结构和功能多样性的影响,取得了以下主要结果：（1）采用平板计数法测定了不同品种转基因水稻对土壤可培养细菌数量的影响。结果显示,转基因水稻土壤各类微生物数量从苗期开始逐渐上升,在孕穗期、抽穗期达到高峰,成熟期各类微生物数量回落。从转基因水稻土壤微生物的组成来看,细菌、真菌、放线菌的组成比例大体一致,数量上放线菌为主,细菌次之,真菌最少。与非转基因水稻亲本相比,转基因水稻土壤微生物数量与其非转基因亲本水稻土壤微生物数量无显著差异；但在不同种植地,转基因水稻间土壤微生物数量差异显著,海拔较高土质较贫瘠的山地寿山试验地位显著低于地势平坦土质较高的吴凤试验地。（2）转基因水稻土壤脲酶活、蛋白酶活、蔗糖酶活、多酚氧化酶活从苗期开始逐渐下降,在孕穗、抽穗期达到峰值,成熟期各酶活有所下降。转基因水稻大致提高了土壤脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性,但均无显著影响。同样不同种植地,转基因水稻间各土壤酶活性差异显著,海拔较高土质较贫瘠的山地寿山试验地位显著低于地势平坦土质较高的吴凤试验地。（3）转基因水稻及其非转基因亲本水稻土壤16SrDNA的PCR扩增片断约为200bp左右,为16SrDNAV3区特异性片段。PCR产物经DGGE分离后,不同品种转基因水稻土壤DGGE条带数比其非转基因亲本的少,差异不显著,说明转基因水稻对土壤细菌群落结构无显著影响。16SrDNA的PCR-DGGE聚类分析说明,不同品种转基因水稻及其非转基因亲本土壤样品中细菌的组成之间的相似性及亲缘关系,转基因水稻及其非转基因对照间相似度较高,但不同试验地相似度较低。（4）运用Biolog法,分析了转基因水稻土壤微生物群落对31种碳源底物代谢反应的平均颜色反应（AWCD）值,通过方差分析、多样性指数分析和主成分分析,结果表明：在孕穗期和抽穗期,转基因水稻土壤微生物群落的代谢特征显著低于其非转基因亲本的；而到了成熟期,转基因水稻土壤微生物群落的代谢特征与其非转基因亲本的无显著差异。同样不同种植地,转基因水稻间各土壤微生物群落的代谢特征差异显著,海拔较高土质较贫瘠的山地寿山试验地位显著低于地势平坦土质较高的吴凤试验地。其中多样性指数Mclntosh指数能较好地反映转基因与非转基因水稻土壤微生物代谢能力的差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 转基因抗虫作物研究现状
• 2 转基因毒蛋白在土壤中的残留动态
• 3 转基因水稻对土壤生态安全的影响
• 3.1 转基因水稻对土壤微生物的影响
• 3.2 转基因水稻对土壤酶活性的影响
• 4 土壤微生物多样性研究方法
• 4.1 传统平板培养法
• 4.2 生物化学方法—磷脂脂肪酸（PLFA）图谱分析法
• 4.3 生理学方法—Biolog微平板法
• 4.4 分子生物学方法
• 4.4.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 4.4.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 4.4.3 荧光原位杂交（FISH）
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 转基因水稻对土壤微生物群落结构的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验区概况与实验设计
• 1.1.1 试验区概况
• 1.1.2 供试水稻材料
• 1.1.3 试验小区设计
• 1.2 材料
• 1.2.1 土壤样品
• 1.2.2 试验培养基
• 1.3 主要仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 土壤含水量的测定
• 1.4.2 平板菌落技术法
• 1.4.3 数据的统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因水稻土壤微生物数量的时间动态
• 2.2 抽穗期转基因水稻对土壤微生物数量的影响
• 3 讨论
• 第三章 转基因水稻对土壤酶活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤样品
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 脲酶活性的测定
• 1.2.2 蛋白酶活性的测定
• 1.2.3 蔗糖酶活性的测定
• 1.2.4 多酚氧化酶活性的测定
• 1.2.5 数据的统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因水稻土壤酶活性的时间动态
• 2.2 孕穗期转基因水稻对土壤酶活性的影响
• 3 讨论
• 第四章 转基因水稻田土壤微生物遗传多样性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤样品
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因水稻土壤微生物总DNA的提取
• 1.2.2 DNA的定性检测
• 1.2.3 对土壤总DNA进行16S rDNA基因的套式PCR扩增
• 1.2.3.1 16S rDNA第一套PCR扩增
• 1.2.3.2 16S rDNA第二套PCR扩增
• 1.2.4 套式PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 1.2.5 变性梯度凝胶电泳（DGGE）后的特异条带分析
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因水稻土壤微生物总DNA的片段大小
• 2.2 转基因水稻土壤16S rDNA的套式PCR扩增产物
• 2.2.1 16S rDNA第一套PCR扩增产物
• 2.2.2 16S rDNA第二套PCR扩增产物
• 2.3 套式PCR产物的DGGE分析
• 2.3.1 16S rDNA的PCR-DGGE图谱分析
• 2.3.2 16S rDNA的PCR-DGGE聚类分析
• 3 讨论
• 第五章 转基因水稻田土壤微生物群落功能多样性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤样品
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 Biolog试验方法
• 1.2.2 统计分析
• 1.2.2.1 转基因水稻土壤微生物群落平均吸光值（AWCD）
• 1.2.2.2 转基因水稻土壤微生物群落功能多样性
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因水稻对土壤微生物群落碳源利用的影响
• 2.1.1 转基因水稻土壤微生物群落平均吸光值（AWCD）动态变化
• 2.1.2 转基因水稻对土壤微生物平均吸光值（AWCD）的影响
• 2.2 转基因水稻土壤微生物群落多样性指数分析
• 2.3 转基因水稻土壤微生物利用碳源主成分分析
• 3 讨论
• 第六章 全文总结
• 1 总结
• 2 本研究存在的不足
• 3 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 附录1 主要仪器
• 附录2 常用术语缩写与中英文对照
• 致谢