论文题目: 成对盒基因Pax9的亚细胞定位及对细胞生物学行为的调控研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 口腔临床医学
作者: 王志峰
导师: 樊明文
关键词: 亚细胞定位,慢病毒
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究的目的在于探讨成对盒基因Pax9的功能,实验从Pax9的亚细胞定位入手研究了Pax9表达改变对细胞生物学行为的影响及可能调控机制。 实验以PCR-重组的方法构建了GFP-Pax9融合蛋白真核表达载体pEGFP-Pax9(GenBankTM检索号:DQ022572),重组质粒转染不同物种来源的哺乳动物细胞CHO、Cos7后在核酸水平（RT-PCR）和蛋白质水平（Western Blot和免疫组织化学）检测细胞与亚细胞水平Pax9的表达,证实了GFP-Pax9融合蛋白的形成;研究用直接荧光（GFP-Pax9融合蛋白）和间接荧光（荧光标记Pax9抗体）两种方式明确标明Pax9在细胞中的作用位置为细胞核;以不同物种来源的细胞进行研究未发现差异结果表明Pax9的作用极为保守。 在不表达Pax9的细胞系Cos7中瞬时表达Pax9,以CellTiter 96?Aqueous one solution cell prol iferation assay检测Pax9—过性表达对细胞生物学行为的影响,流式细胞仪分析了Pax9表达对细胞周期的改变,RT-PCR法检测了生长因子Bmp2、Bmp4、Fgf8和Shh在Pax9表达前后的改变,寻求Pax9可能的信号路径:结果发现:Pax9的表达对细胞有促进增殖作用,细胞周期显示为G2/M期细胞所占比例增加,但Pax9对Cos7细胞的增殖作用并不是通过对生长因子Bmp2、Bmp4、Fgf8和Shh的调控引起的。 基因过表达和基因表达抑制是研究基因功能的经典方法。实验构建了携带GFP-Pax9融合蛋白编码基因、Neo抗性基因和SV40 T抗原编码基因的慢病毒质粒pLL-Pax9,通过四质粒系统在HEK 239T细胞中对病毒进行包装后感染Cos7细胞并对使用G418对转染细胞进行筛选,获取稳定表达Pax9的细胞克隆;荧光显微镜下显示细胞克隆细胞核中表达绿色荧光;RT-PCR检测显示细胞克隆表达Pax9。 Pax9基因表达抑制的研究通过RNA干扰技术实现;GFP-Pax9融合蛋白的构建成功证明可以用绿色荧光的粹灭显示Pax9的表达抑制效果。实验针对Pax9
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
实验流程
正文
文献综述
实验研究
实验一 绿色荧光蛋白-成对盒基因Pax9融合蛋白真核表达质粒的构建、表达及Pax9亚细胞定位
实验二 Pax9瞬时表达对细胞生物学行为的影响及信号路径探讨
实验三 绿色荧光蛋白-成对盒基因Pax9融合蛋白慢病毒质粒的构建及Pax9稳定表达细胞的筛选
实验四 不同方法表达Pax9 siRNA及其干扰能力初步比较
附录
个人简历
后记
发布时间: 2006-03-27
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