斑马鱼选择素及配体PSGL-1的研究

论文摘要

斑马鱼是一种小型热带鱼种,因为具有许多内在的优势:体型小、产卵量多、早期胚胎发育透明、体外发育、与哺乳动物相似的生理学特征等,已成为研究发育生物学和人类疾病的重要模式生物。选择素是细胞粘附分子家族成员之一,选择素家族包括P-选择素、L-选择素和E-选择素3个成员,P-选择素表达于激活的血管内皮细胞和血小板,L-选择素表达于白细胞,E-选择素表达于激活的血管内皮细胞。选择素在炎症、血栓形成、肿瘤转移等多种疾病中起重要作用。对选择素的深入研究,将对相关疾病的发病机制、诊断和治疗具有重要意义。人们对哺乳动物选择素已有深入的研究,在低等脊椎动物,未见与选择素相关的研究报道。本研究首次克隆斑马鱼P-选择素和PSGL-1基因全长cDNA序列,分析他们的进化学和时空表达模式,初步探讨斑马鱼P-选择素的生物学功能。本研究还首次克隆了包含完整开放阅读框架的斑马鱼L-选择素基因的部分cDNA序列,预测了斑马鱼E-选择素基因的编码区序列,分析了斑马鱼L-选择素基因的表达和L-与E-选择素基因的进化学。在此基础上,通过生物信息学软件预测斑马鱼P-选择素和PSGL-1基因的启动子,分析启动子区的调控原件和潜在的转录因子结合位点。斑马鱼P-选择素基因全长cDNA序列2,800 bp,开放阅读框2,607 bp,5’非编码区111 bp,3’非编码区82 bp。斑马鱼P-选择素基因包含16个外显子和15个内含子,定位于斑马鱼第20号染色体。斑马鱼P-选择素基因编码868个氨基酸组成的蛋白,蛋白的理论分子量122.36 KD,等电点6.27。斑马鱼P-选择素蛋白有25个氨基酸组成的信号肽,富含半胱氨酸（69个半胱氨酸,占氨基酸总量的8%）,这和已知的哺乳动物的P-选择素蛋白相似。斑马鱼的P-选择素蛋白和已知哺乳动物的P-选择素蛋白同源性37-39%。Smart分析显示斑马鱼P-选择素蛋白与哺乳动物P-选择素蛋白一样,有5个明显的保守结构功能域:N端外源凝集素结构域、表皮生长因子样结构域、重复次数不同的补体结合蛋白结构域、跨膜区和短的胞浆尾部。进化分析显示斑马鱼P-选择素蛋白与哺乳动物P-选择素蛋白在不同的进化枝,表明他们有相对远的进化关系,亦与斑马鱼和哺乳动物在生物分类学中的地位一致。为了阐明斑马鱼P-选择素的功能,通过实时定量PCR和整体原位杂交检测斑马鱼P-选择素在早期发育中表达。实时定量PCR结果显示:斑马鱼P-选择素基因在0.2到96 hpf各个时期均有表达;从0.2到72 hpf表达量逐步增高,96 hpf下降;72 hpf表达量最高,72 hpf的表达与其他各发育期均有显著差异。整体原位杂交结果显示:在4 hpf,能检测到斑马鱼P-选择素基因转录;在90%体节期,胚胎前部有明显P-选择素表达;在12 hpf,表达呈普遍性;在18 hpf,头部区域、躯干背主动脉和体轴静脉有明显表达;在24-72 hpf,在头部区域和循环系统有明显表达。实时定量PCR和整体原位杂交的结果表明,斑马鱼P-选择素基因是母系来源的基因,可能为胚胎早期发育所必需,参与斑马鱼早期多个器官和组织发育,特别是血管的发育。为了进一步研究斑马鱼P-选择素的生物学功能,我们通过实时定量PCR检测了ADP对斑马鱼P-选择素基因表达的影响。结果显示,100μM ADP处理84 hpf斑马鱼,在处理后30 min内斑马鱼P-选择素表达明显上调。处理后2 min表达量已显著升高,处理后8 min表达量最高,处理后15和30 min表达量下降。表明斑马鱼P-选择素可能参与血栓形成。本研究表明P-选择素功能结构域在物种间高度保守,斑马鱼P-选择素基因在斑马鱼早期发育中起重要作用,并可能参与血栓形成。本研究首次表明P-选择素在早期发育中起重要作用。因此,本研究使人们对P-选择素的结构和功能有了更深入的了解。斑马鱼L-选择素基因部分cDNA序列1,005 bp,包含完整的开放阅读框架,斑马鱼L-选择素基因位于斑马鱼第20号染色体。斑马鱼L-选择素基因编码324个氨基酸组成的蛋白,蛋白的理论分子量35.93 KD,等电点6.21。斑马鱼的L-选择素蛋白和已知哺乳动物的L-选择素蛋白同源性28-32%。Smart分析显示斑马鱼L-选择素蛋白与哺乳动物L-选择素蛋白一样,有5个明显的保守结构功能域:N端外源凝集素结构域、表皮生长因子样结构域、重复次数不同的补体结合蛋白结构域、跨膜区和短的胞浆尾部。进化分析显示斑马鱼L-选择素蛋白与哺乳动物L-选择素蛋白在不同的进化枝,表明他们有相对远的进化关系,亦与斑马鱼和哺乳动物在生物分类学中的地位一致。为了阐明斑马鱼L-选择素的功能,通过RT-PCR分析斑马鱼L-选择素基因在斑马鱼胚胎发育中表达。结果显示,斑马鱼L-选择素基因从0.2 （1-cell）到72 hpf各个时期均有表达。表明斑马鱼L-选择素基因是母系来源的基因,可能为胚胎发育所必需。本研究表明L-选择素蛋白功能结构域在物种间高度保守,L-选择素基因在斑马鱼胚胎发育中起重要作用。本研究首次表明L-选择素基因在胚胎发育中起重要作用。因此,本研究使人们对L-选择素的结构和功能有了更深入的了解。预测的斑马鱼E-选择素基因编码区序列2,241 bp,编码746个氨基酸组成的蛋白,蛋白的理论分子量82.47 KDa,等电点4.60。预测的斑马鱼E-选择素基因定位于斑马鱼第20号染色体。预测的斑马鱼E-选择素蛋白和已知哺乳动物的E-选择素蛋白同源性39-41%。Smart分析显示斑马鱼E-选择素蛋白与哺乳动物E-选择素蛋白一样,有5个明显保守结构功能域:N端外源凝集素结构域、表皮生长因子样结构域、重复次数不同的补体结合蛋白结构域、跨膜区和短的胞浆尾部。进化分析显示预测的斑马鱼E-选择素蛋白与哺乳动物E-选择素蛋白在不同的进化枝,表明他们有相对远的进化关系,亦与斑马鱼和哺乳动物在生物分类学中的地位一致。本研究表明E-选择素蛋白功能结构域在物种间高度保守,本研究为深入探讨斑马鱼E-选择素的结构和功能奠定基础。斑马鱼PSGL-1基因cDNA序列全长1,584 bp,开放阅读框架855 bp,5’非编码区172 bp,3’非编码区557 bp。斑马鱼PSGL-1有2个外显子和1个内显子,定位于斑马鱼的第5号染色体。斑马鱼PSGL-1基因编码有284个氨基酸组成的蛋白,蛋白理论分子量30.33 KDa,等电点7.96。斑马鱼PSGL-1蛋白有27个氨基酸组成信号肽,是一种分泌性蛋白。斑马鱼PSGL-1蛋白第29-93位的氨基酸是潜在的P-选择素结合区域。该区域第86位的酪氨酸,是潜在的硫酸化位点;有12个苏氨酸残基,是潜在O-糖基化位点;5个NXS/T共有序列,是潜在的N-糖基化位点。斑马鱼PSGL-1蛋白的整个胞外结构域有31个苏氨酸残基和22个丝氨酸残基,是潜在的O-糖基化位点;8个NXS/T共有序列,是潜在的N-糖基化位点。有160个氨基酸组成的胞外结构域,富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸,具有粘性蛋白的特征,但在整个胞外结构域未见明显的重复序列。斑马鱼PSGL-1蛋白的氨基酸序列有5个半胱氨酸残基,位于第11、174、188、208和232位。Cys11位于信号肽域,Cys174和Cys188位于胞外结构域,Cys208位于跨膜结构域,Cys232位于胞内结构域。Cys188恰位于胞外结构域和跨膜结构域的连接处。斑马鱼的PSGL-1蛋白与其他已知哺乳动物的PSGL-1蛋白同源性19-22%。Smart分析显示斑马鱼PSGL-1蛋白与哺乳动物PSGL-1蛋白一样,有160个氨基酸组成的大的胞外结构域、23个氨基酸组成的跨膜结构域和73个氨基酸组成的胞内结构域组成。斑马鱼PSGL-1蛋白的信号肽域、胞外结构域、跨膜区和胞内域与人、小鼠、大鼠、马、牛和猪的PSGL-1蛋白对应区域的序列同源性分别为23-35%,13-16%,39-47%和33-37%。进化分析显示斑马鱼PSGL-1蛋白与哺乳动物PSGL-1蛋白在不同的进化枝,表明他们有相对远的进化关系,亦与斑马鱼和哺乳动物在生物分类学中的地位一致。为了研究斑马鱼PSGL-1的功能,通过RT-PCR和原位杂交方法检测了PSGL-1基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达模式。结果显示,斑马鱼PSGL-1基因从单细胞期到72 hpf表达逐步增长。PSGL-1在单细胞期表达量较少;从12到26 hpf和26到48 hpf,PSGL-1表达快速增长;在48和72 hpf,表达维持在相对高的水平。90%包被期,PSGL-1表达在胚胎前部出现;12 hpf,表达呈普遍行;26 hpf,在胚胎头部、躯干腹侧体节、间质细胞群区和腹侧循环系统有强的表达;在48 hpf,在头部区域、间质细胞群区和腹侧循环系统继续有强的表达,在躯干的表达由腹侧体节扩展至整个躯干腹侧;在72 hpf,PSGL-1在头部表达缩至心血管系统,在躯干的表达由躯干腹侧扩到整个躯干,在间质细胞群区和腹侧循环系统仍有强的表达,在尾部区域未见表达。表明PSGL-1是母系来源的基因,可能为胚胎早期发育所必需,参与多个器官和组织发育,特别是体节发育。本研究表明PSGL-1蛋白功能结构域在物种间高度保守,但在不同物种间胞外结构域初级结构保守性差;PSGL-1蛋白的P-选择素识别域,可硫酸化的酪氨酸残基、O-连接的糖基化位点以及位于胞外结构域和穿膜结构域连接处起二聚化作用的半胱氨酸残基,在鱼和哺乳动物间高度保守。本研究首次表明PSGL-1在胚胎发育中起重要作用。因此,本研究使人们对PSGL-1的结构和功能有了更深入的了解。斑马鱼P-选择素基因启动子候选区域在翻译起始位点ATG上游873-3000 bp,斑马鱼PSGL-1基因启动子候选区域在翻译起始密码子ATG上游2012-3500 bp。斑马鱼P-选择素基因启动子候选区域存在7个TATAbox,没有CAATbox和GCbox;斑马鱼PSGL-1基因启动子候选区域存在1个TATAbox和1个CAATbox,没有GCbox。斑马鱼P-选择素和PSGL-1基因启动子候选区域没有CpG岛。通过TFSEARCH分析斑马鱼P-选择素和PSGL-1基因启动子候选区域潜在的转录因子结合位点,评分在90分以上。结果显示,斑马鱼P-选择素基因启动子候选区域具有CdxA、SRY、Nkx-2、AML-1a、Sox-5、S8、Oct-1、HFH-2、HNF-3b、Pbx-1、HFH-1、STATx、Brn-2、HSF2、GATA-1、TATA、c-Myc/、C/EBP、c-Rel、XFD-1、AP-1和YY潜在的转录因子结合位点;斑马鱼PSGL-1基因启动子候选区域具有SRY、CdxA、Nkx-2、AML-1a、Sox-5、S8、Oct-1、HNF-3b、GATA-1、C/EBP Evi-1、MZF1和AP-1潜在的转录因子结合位点。本研究有助于我们更好理解选择素家族及配体PSGL-1基因进化,为揭示斑马鱼的发育机制及阐明在生物进化过程中基因功能变化提供了重要资料,进一步加深了我们对斑马鱼胚胎发育分子机理的理解。并可能为包括心脑血管疾病在内的多种疾病的的致病机理的研究提供了一种新的疾病模型,为这些疾病的诊断和治疗提供更多新的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 综述
• 1 斑马鱼
• 2 选择素家族
• 2.1 P-选择素
• 2.2 L-选择素
• 2.3 E-选择素
• 3 P-选择素糖蛋白配体1
• 4 本课题开展的目的及意义
• 第二部分 实验
• 第一章 斑马鱼P-选择素基因的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 斑马鱼总RNA 的纯度和完整性分析
• 2.2 斑马鱼P-选择素基因的克隆
• 2.3 斑马鱼P-选择素基因的cDNA序列分析
• 2.4 斑马鱼P-选择素基因编码蛋白的序列分析
• 2.5 多序列比对和系统进化分析
• 2.6 斑马鱼P-选择素基因的基因组序列分析
• 2.7 P-选择素基因在斑马鱼早期发育中的表达
• 2.8 ADP对斑马鱼P-选择素基因表达的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 斑马鱼L-选择素基因的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 斑马鱼总RNA 的纯度和完整性分析
• 2.2 斑马鱼L-选择素基因的克隆
• 2.3 斑马鱼L-选择素基因部分cDNA序列分析
• 2.4 斑马鱼L-选择素基因编码蛋白的序列分析
• 2.5 多序列比对和系统进化分析
• 2.6 斑马鱼L-选择素基因部分cDNA序列的基因组分析
• 2.7 L-选择素基因在斑马鱼胚胎发育中的表达
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 斑马鱼E-选择素基因的研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 斑马鱼E-选择素基因的预测
• 2.2 预测的斑马鱼E-选择素基因编码区序列分析
• 2.3 预测的斑马鱼E-选择素基因编码蛋白的序列分析
• 2.4 多序列比对和系统进化分析
• 2.5 预测的斑马鱼E-选择素基因编码区序列的基因组分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 斑马鱼PSGL-1基因的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 斑马鱼总RNA 的纯度和完整性分析
• 2.2 斑马鱼PSGL-1基因的克隆
• 2.3 斑马鱼PSGL-1基因的cDNA序列分析
• 2.4 斑马鱼PSGL-1 基因编码蛋白的序列分析
• 2.5 多序列比对和系统进化分析
• 2.6 斑马鱼PSGL-1基因的基因组序列分析
• 2.7 PSGL-1 基因在斑马鱼胚胎发育中的表达
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 斑马鱼P-选择素和PSGL-1 基因启动子分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 斑马鱼基因组DNA 分析
• 2.2 斑马鱼P-选择素和PSGL-1 基因翻译起始密码子上游5Kb 序列扩增
• 2.3 斑马鱼P-选择素和PSGL-1 基因启动子预测
• 2.4 斑马鱼P-选择素和PSGL-1 基因启动子分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 本论文的主要创新点
• 参考文献
• 攻读博士学位论文期间发表的学术论文
• 致谢