PDDV诱生内源性IFN-γ对小鼠血吸虫病肝纤维化下调作用的研究

论文摘要

血吸虫病是一种世界性的主要公共卫生疾病,流行于全球74个国家和地区,主要分布于亚洲、非洲和拉丁美洲。我国历经半个多世纪的积极防治取得了巨大的成绩,但是近年来,我国血吸虫病有卷土重来之势。目前全国共有血吸虫病人67万多人,主要是慢性和晚期血吸虫病人（慢血和晚血）。慢血病人多发生肝纤维化继而发展为晚血的肝硬化,治愈非常棘手。血吸虫病是一种免疫性疾病。血吸虫不同虫期释放的抗原均能诱发宿主的免疫应答,尤以虫卵引起的肝肠虫卵肉芽肿最为严重,并进而发生纤维化、甚至硬化,是慢血和晚血病人的主要病理表现。由此导致的肝脾肿大、门脉高压和其他并发症是晚血病人死亡的主要原因。肝纤维化的治疗涉及祛除病因、抗氧化抗炎、调节肝脏胶原代谢、改善微循环及代谢障碍、减少并发症（如门脉高压等）等诸多环节,现今尚缺乏很有效的抗纤维化药物及方法。因此,探索阻遏肝纤维化发生、发展的新途径、新方法,不仅对血吸虫病肝纤维化,而且对其他慢性肝病引起的肝纤维化的治疗都极具价值。肝纤维化是肝脏对多种病因慢性刺激所致的损伤后修复反应,其特征是细胞外基质（ECM）的过度沉积。CD4+T细胞在纤维化发展过程中发挥关键作用,其亚型作用不同并相互抑制。基因芯片研究亦表明,Th1与Th2极化在慢性炎症反应中呈现不同的基因表达类别。Th1型极化主要涉及急性期反应和细胞凋亡,Th1型应答的持续进行可造成大量细胞死亡及组织损伤,主要细胞因子如IFN-γ。与之相反,Th2型极化涉及损伤修复与纤维化反应,主要细胞因子如IL-4,IL-5和IL-13。研究集中在如下基因中,如Ⅰ型溶胶原、Ⅲ型溶胶原、精氨酸酶、赖氨酰、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）。许多研究证明,与曼氏血吸虫的研究报道相似,日本血吸虫感染小鼠同样存在Th1-Th2免疫漂移现象:Th1型细胞因子（如IFN-γ）与血吸虫肉芽肿的诱导和形成密切相关,而Th2型细胞因子（如IL-4,IL-13）可抑制Th1型细胞因子,在纤维化进程中起重要作用。因此在肝纤维化形成过程中,如何上调Th1型应答以恢复机体正常的Th1/Th2应答平衡,对预防、减轻甚至阻止肝纤维化的进程可能将起到关键作用。本室李光富、王新军等先前在执行国家自然科学基金项目——“诱导Th1应答的日本血吸虫复合表位抗原对小鼠的保护作用的研究”（No.30271166）中,用C57BL/6（H-2b）小鼠从日本血吸虫疫苗候选分子Sj22.6（表膜抗原）、Sj28GST（谷胱甘肽-S-转移酶）、SjTPI（磷酸丙糖异构酶）、Si97（副肌球蛋白）中分别筛选并鉴定出Th1型P4和P6,以及多个T细胞表位,本研究中进一步鉴定其中诱导较强Th1型应答的抗原表位P18、P22。先前也已筛选出种属特异性强、引发C57BL/6小鼠高Th1型应答的免疫佐剂CpG ODN1826。本研究借鉴PDDV（peptide-DNA dual vaccine）技术,将Th1型表位肽P4、P6、P18、P22分别与含相应编码DNA和佐剂CpG ODN（CpG oligodeoxynucleotide）1826的重组质粒结合而制备混合多价疫苗PDDV,以期用混合PDDV免疫小鼠,上调其Th1型应答,诱导内源性IFN-γ产生,从而最终达到下调血吸虫病肝纤维化的目的。第一部分:进一步鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶和副肌球蛋白的Th1型表位,为构建复合多价疫苗奠定基础。磷酸丙糖异构酶（TPI）是WHO/TDR提出的针对曼氏血吸虫（Sehistosoma mansoni,Sm）的6个最具潜力的疫苗候选分子之一。Reynolds等发现重组的TPI（rTPI）在较强的Th2微环境下仍可诱导产生Th1型细胞因子,并从SmTPI序列中进一步筛选出了C57BL/6J小鼠特异的T细胞表位SmTPI-P18,以及CBA小鼠而非C57BL/6J小鼠特异性的T细胞表位SmTPI-P9。日本血吸虫中国大陆株的TPI（SjTPI）与SmTPI有84%的同源性,成虫来源的TPI、重组rSjTPI以及SjTPI DNA疫苗等多种形式都显示了较好的抗感染和一定的抗病理损伤作用。先前王新军等根据Reynolds等报道的SmTPI-P18及SmTPI-P9,设计了SjTPI同源序列部分的相应表位SjTPI-P18及对照表位SjTPI-P9,并已鉴定SjTPI-P18是C57BL/6J小鼠特异的T细胞表位。本研究中用重组rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激经重组rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞,检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平;再用高纯度的合成表位肽SiTPI-P18刺激经SjTPI-P18加完全弗氏佐剂（CFA）免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞,检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平。副肌球蛋白是人和家畜多种寄生虫的候选疫苗抗原,曼氏血吸虫副肌球蛋白（Sm97）也是WHO确定的6个最具潜力的疫苗候选分子之一。副肌球蛋白能激发较强的体液免疫和细胞免疫,其诱导的抗感染免疫保护力与其诱导机体Th1/Th2型免疫应答向Th1型偏移的程度及水平成正相关,同时具有一定的抗虫卵肉芽肿及肝纤维化作用。王新军等用SYFPEITHI软件预测Sj97的5个T细胞表位,重组并表达为硫氧还蛋白（TRX）融合蛋白,用此融合蛋白体外刺激C3H/HeJ和C57BL/6小鼠淋巴细胞,通过3H-TdR掺入法检测,发现P22刺激C57BL/6小鼠致敏淋巴细胞的增殖指数最高,提示P22可能是Sj97较好的T细胞表位。本研究中用人工合成肽Sj97-P22刺激经Sj97-P22加弗氏佐剂免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞,采用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果;ELISA法检测其细胞培养上清中IL-2、IFN-γ、IL-4水平。结果:SjTPI-P18及rSjTPI-P18均可刺激经rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高（P均＜0.05）及IL-4水平降低;SjTPI-P18可刺激经SjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高及IL-4水平降低（P均＜0.05）。因此,SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位,而且在相同免疫剂量情况下人工合成肽的免疫原性优于重组肽。Sj97表位鉴定中,Sj97-P22可刺激经Sj97-P22免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,其细胞培养上清中IL-2和IFN-γ分泌水平升高（P均＜0.05）,IL-4分泌水平降低。因而表明Sj97-P22也是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。第二部分:借鉴PDDV技术,用筛选鉴定出的Th1型抗原表位P4、P6、P18、P22及Th1型免疫佐剂CpG ODN1826,构建混合PDDV并进行免疫学鉴定。PDDV是Wu YZ等首先在治疗乙肝病毒的研究中构建的一个新的疫苗形式,借鉴基因治疗方法中阳离子肽作为DNA的非病毒载体的技术,将表位肽疫苗和DNA疫苗结合构建的一种新的疫苗形式。本研究第一部分及本室先前工作已经从疫苗候选分子中共筛选鉴定了4个Th1型表位肽——P4、P6、P18、P22,还筛选出种属特异性强、引发C57BL/6小鼠高Th1型应答的免疫佐剂CpG ODN1826。我们借鉴PDDV技术,设计在pCI-neo表达载体中重组含有Th1型抗原表位基因和诱导Th1型应答的免疫佐剂CpG ODN1826的核苷酸序列,并合成18个赖氨酸与其相应表位肽抗原的阳离子聚合物,在特定条件下使阳离子聚合物吸附在含有抗原表位和佐剂的重组载体周围,成功制备了符合要求的颗粒状PDDV。本研究进一步观察4个表位肽等量混合物刺激经4种PDDV等量混合物免疫小鼠后的淋巴细胞增殖效果及淋巴细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-4分泌水平,并观察混合PDDV的免疫原性及诱导优势Th1型应答的特征。结果:通过沉淀试验得出阳离子肽能够有效结合DNA的盐浓度范围;阻滞试验及DNaseⅠ消化试验得出阳离子肽有效保护DNA免受DNA酶降解的较适盐浓度及电荷比值（r）条件;用透射电镜观察证实:在r=4、150 mM NaCl、40 mM HEPES时可以获得形态均一、直径约为20 nm的符合要求的PDDV颗粒。在用P4、P6、P18、P22分别制备的4种PDDV等量混合物免疫C57BL/6小鼠后,观察到P4、P6、P18、P22表位肽等量混合物可刺激免疫小鼠淋巴细胞增殖,分泌IL-2和IFN-γ水平升高（P均＜0.05）,IL-4水平降低。本研究初步证实:混合PDDV可优势诱导C57BL/6小鼠体内的Th1型免疫应答,刺激机体产生高水平的内源性IFN-γ,为进一步观察混合PDDV对血吸虫慢性感染小鼠肝纤维化下调作用的影响奠定基础。第三部分:混合抗原表位PDDV对血吸虫感染小鼠肝纤维化下调作用的研究肝纤维化的发生、发展涉及多种复杂因素的刺激和调节,其根本原因是胶原的合成多于降解。主要的胶原生成细胞是肝星状细胞（HSC）,而且纤维生成和溶解中基质重建的主要成分是基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制因子（MMPs/TIMPs）,MMP-9/TIMP-1平衡起关键作用。众多研究表明,Th2型细胞因子能够下调MMP-9/TIMP-1表达的平衡致使ECM沉积增多,并通过对HSC活化的调节等诸多关键环节促进肝纤维化发展。而以IFN-γ为主的Th1型细胞因子则能通过多种途径抑制已活化的HSC,使其向静息型转变,并双相调节MMP-9,主要对纤维化起下调作用。血吸虫感染后形成虫卵肉芽肿直至发生肝纤维化,存在着Th1型应答向Th2型应答漂移现象而使Th1/Th2平衡紊乱。因此通过上调Th1型应答恢复Th1/Th2平衡,上调MMP-9/TIMP-1平衡,从而抑制HSC活化,促使ECM的溶解和重建,对减轻肝纤维化发展有着重要意义。在第二部分研究中,已经成功构建能够诱导小鼠体内Th1型优势应答的混合PDDV,本部分的研究旨在用此混合PDDV免疫日本血吸虫感染14w并经吡喹酮治疗的C57BL/6小鼠,通过最直观的肝脏病理学指标（肝纤维化评分、肝脏虫卵肉芽肿面积）观察其肝纤维化程度变化;通过免疫组化观察HSCs活化标志物α-SMA、胶原及相关酶谱CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1、MMP-9以及细胞因子IFN-γ的表达情况;通过RT-PCR方法观察α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、IL-4、IL-13、TGF-β1、IFN-γ在mRNA水平上的表达丰度;通过检测血清中IFN-γ和IL-4含量以及SWAP特异的抗体IgG、IgG1、IgG2a和IgG1/IgG2a比值以观察不同时间点（0 w,10 w,14 w,25 w）免疫小鼠体内细胞免疫及体液免疫应答的变化。并试图探讨混合PDDV对血吸虫慢性感染小鼠肝纤维化形成过程中肝纤维化发展产生影响的原因。结果:混合表位-CpG PDDV组小鼠肝脏的纤维化程度减轻,肝脏虫卵肉芽肿面积减小;免疫组化结果显示肝脏的α-SMA、CollagenⅠ、TIMP-1表达下降,肝脏的MMP-9表达升高,与溶剂对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）;且肝脏的IFN-γ表达水平升高以及CollagenⅢ表达水平下降,但与溶剂对照组比较无统计学意义。半定量RT-PCR显示观察肝脏组织胶原和细胞因子的mRNA表达水平时发现,混合表位-CpG PDDV组的α-SMA、CollagenⅢ、TGF-β1、IL-4、IL-13的mRNA表达水平下降与溶剂对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）;而CollagenⅠ的mRNA表达水平下降及IFN-γ的mRNA表达水平上升,与溶剂对照组比较无统计学意义。血清细胞因子检测显示,混合表位-CpG PDDv免疫组小鼠血清中分泌IFN-γ水平在治疗后显著增高（P＜0.05）,分泌IL-4水平未见明显变化,第25w时以混合表位-CpG PDDV组分泌IFN-γ水平为最高,但各组间比较无统计学意义。血清中SWAP特异的抗体IgG、IgG1、IgG2a检测显示,混合表位-CpG PDDV组的IgG、IgG2a水平随时间点逐渐上升,IgG1水平在第14 w比第10 w显著上升但第25 w与第14 w水平接近,第25 w的IgG1/IgG2a比值比第14 w降低。综上,本研究观察到混合表位-CpG PDDV免疫的血吸虫慢性感染小鼠,其汇管区及虫卵肉芽肿周围纤维增生和炎性浸润明显减轻,肝纤维化程度减轻;肝脏细胞因子IL-4、IL-13、TGF-βmRNA水平显著下降,IFN-γmRNA水平上升;肝脏的蛋白表达水平上,IFN-γ表达相应增高,MMP-9表达明显增高,TIMP-1表达明显下降;血清细胞因子和抗体检测都显示了Th1/Th2上调现象。并同时观察到混合表位-CpG PDDV免疫后小鼠肝脏α-SMA在蛋白和mRNA水平上的表达量均显著降低,Ⅰ型、Ⅲ型胶原在蛋白和mRNA水平上表达量均减少,提示混合表位-CpG PDDV可抑制HSC的激活并减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生。因此,混合表位-CpG PDDV可能是通过诱导表达IFN-γ为主的Th1型应答促进Th1/Th2平衡上调,从而使MMP-9/TIMP-1的平衡上调;并调控HSC的活化及ECM的生成,导致对肝纤维化的下调作用。本研究已成功制备了可诱导C57BL/6小鼠体内产生较高水平IFN-γ的呈现优势Th1型应答的混合多价疫苗——混合表位-CpGPDDV;并观察到其能减轻血吸虫慢性感染小鼠肝纤维化的发展,对其他因素引起的肝纤维化的下调研究亦具重要意义。

论文目录

• 英文缩略词的中英文全文对照
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• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 日本血吸虫磷酸丙糖异构酶及副肌球蛋白TH1型表位的免疫学鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 日本血吸虫混合抗原表位PDDV疫苗的构建及免疫学鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 日本血吸虫混合抗原表位PDDV对小鼠血吸虫病肝纤维化下调作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• REFERENCES
• 附录
• 致谢
• 文献综述