百脉根共生信号途径中CASTOR及其相互作用蛋白的研究

论文摘要

CASTOR编码百脉根（Lotus iaponicus）中的离子通道蛋白，它是共生途径上的功能基因，作用于结瘤因子诱导产生的钙离子激增（calcium spiking）信号转导途径的上游，突变后不能形成根瘤。为了进一步揭示CASTOR调控共生信号途径的分子机制，本文构建了百脉根的cDNA文库，并通过酵母双杂交系统在百脉根的cDNA文库中筛选可能与CASTOR相互作用的蛋白。以接种根瘤菌（Mesorhizobium loti）后2，4，8，12d的百脉根植株为材料提取总RNA，按照酵母双杂交试剂盒提供的方法构建百脉根的cDNA文库。文库构建后经有限稀释法测定的cDNA文库效率为2×106个转化子／3ug pGADT7-Rec。菌落PCR显示文库的cDNA片段大部分在500bp至2kb之间，文库构建较成功而且无污染。成功构建了CASTOR-RCK-BD重组质粒，并以其为诱饵筛选百脉根的cDNA文库。初筛获得111个阳性克隆，经X-Gal检测以及回转酵母验证进一步确认有99个蓝色克隆子，测序以及NCBI BLAST比对分析鉴定出JABl、clpA、钙调素结合的翻译延伸因子等7种可能与CASTOR相互作用的蛋白。其中阳性克隆中钙调素结合的翻译延伸因子的数目最多，占总数的30％以上，而且蛋白的同源性也达到了90％，经DNAMAN等软件分析发现它们可以分为5类。利用RT-PCR方法检测了这些基因在接种以及不接种根瘤菌的百脉根中的表达水平，结果显示钙调素结合的翻译延伸因子在接种根瘤菌6d的表达量最高，JABI随着接种天数的增加其表达量也有相应的提高，表明这两种蛋白的表达跟根瘤菌的接种有密切关系。而clpA和泛醌氧化还原酶亚基在接种及不接种根瘤菌的百脉根中，表达量无明显差异。分析推测CASTOR可能与上述蛋白形成复合物参与共生信号的转导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 共生固氮
• 1.1.1 根瘤菌的生理性状与分类
• 1.1.2 豆科植物根瘤形成的过程
• 1.1.3 早期共生信号转导的分子机制
• 1.1.4 钙离子流动与钙离子激增
• 1.2 离子通道
• 1.2.1 离子通道的分类、功能与研究方法
• 1.2.2 钙离子通道
• 1.3 酵母双杂交系统
• 1.3.1 酵母双杂交的原理
• 1.3.1.1 酵母双杂交系统的局限性
• 1.3.2 酵母单杂交系统
• 1.3.3 三杂交系统
• 1.3.4 反向双杂交系统和反向单杂交系统
• 1.3.5 哺乳动物细胞双杂交系统和细菌双杂交系统
• 1.3.6 核外双杂交系统
• 1.4 研究的背景、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 营养液和培养基配方
• 2.1.4 常用贮存液和缓冲液配方
• 2.1.5 植物材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA的抽提和纯化
• 2.2.2 RT-PCR合成cDNA第一链
• 2.2.3 诱饵质粒的构建
• 2.2.4 cDNA文库的构建和鉴定
• 2.2.4.1 用Oligo（dT）引物合成cDNA第一链
• 2.2.4.2 通过LD-PCR（Long Distance）扩增双链cDNA
• 2.2.4.3 双链cDNA的纯化
• 2.2.4.4 酵母感受态细胞的制备
• 2.2.4.5 将ds cDNA和pGADT7-Rec转化AH109感受态细胞
• 2.2.4.6 在SD/-Leu的平板上筛选转化子
• 2.2.4.7 收集转化子
• 2.2.4.8 菌落PCR
• 2.2.4.9 酵母质粒的抽提
• 2.2.5 酵母双杂交筛选
• 2.2.5.1 检测DNA-BD融合蛋白的转录活性
• 2.2.5.2 诱饵菌株的毒性测试
• 2.2.5.3 诱饵菌株和文库菌株杂交
• 2.2.6 RT-PCR
• 2.2.7 POLLUX-RCK-pGADT7与CASTOR-RCK-pGADT7重组子的构建
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞（电转）的制备以及转化
• 2.2.9 大肠杆菌质粒的抽提
• 3 结果与分析
• 3.1 CASTOR-RCK-BD Bait的构建
• 3.2 百脉根cDNA文库的构建以及鉴定
• 3.3 CASTOR-RCK-BD Bait与cDNA文库的杂交和阳性克隆的筛选
• 3.4 菌落PCR分析阳性克隆子
• 3.5 对阳性克隆的pGADT7-cDNA质粒进行测序和生物信息学分析
• 3.6 阳性克隆在百脉根中表达量分析
• 3.7 POLLUX-RCK-pGADT7与CASTOR-RCK-pGADT7重组子的构建
• 3.8 CASTOR与CASTOR以及CASTOR与POLLUX的相互作用
• 4 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况