hTERT启动子调控的TRAIL基因诱导乳腺癌细胞凋亡作用的研究

论文摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在一些城市已是妇女恶性肿瘤发病的首位,成为妇女健康的最大威胁。虽然阿霉素是治疗乳腺癌最有效的化疗药物之一,但大部分晚期乳腺癌患者经过联合化疗后复发率仍很高。因此,寻找解决乳腺癌耐药的新治疗方法至关重要。基因治疗是近年来肿瘤防治的重要研究领域,但其缺乏肿瘤靶向性是限制其疗效的重要原因。利用组织特异性的启动子来介导目的基因,从而限制目的基因只在靶细胞中表达,是肿瘤靶向性基因治疗的一种新的途径,有望解决基因治疗缺乏靶向性的问题。本研究目的是通过构建肿瘤特异性启动子hTERT调控的TRAIL真核表达质粒,探讨其对乳腺癌细胞特异性诱导凋亡的作用。我们构建了hTERT启动子调控的TRAIL真核表达质粒（phTERT-TRAIL-EGFP）,用脂质体法把构建的phTERT-TRAIL-EGFP质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231和人胚肺成纤维细胞WI38,用MTT法检测细胞增殖变化及FCM、TUNEL染色法检测细胞凋亡,并用RT-PCR检测凋亡相关基因（cyclin E、CDK2、p27）mRNA表达变化,Western blot检测凋亡相关蛋白（TRAIL、caspase-3、NF-κB）表达变化。结果显示,重组质粒phTERT-TRAIL-EGFP和pCMV-TRAIL-EGFP抑制了乳腺癌细胞的增殖,诱导了乳腺癌细胞的凋亡,hTERT启动子与强效CMV启动子相比较对TRAIL有相同的表达调控作用,其在诱导乳腺癌细胞凋亡作用上稍优于CMV启动子。凋亡执行因子caspase3的表达上调,而与细胞存活相关的蛋白NF-κB表达则下调;调控细胞周期的cyclin E和CDK2基因表达下调,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p27基因表达明显增高。说明重组质粒在hTERT启动子和CMV启动子调控下,表达翻译了TRAIL蛋白,TRAIL通过上调p27的表达而抑制CDK2/CyclinE激酶活性,抑制了乳腺癌细胞的增殖。TRAIL诱导的信号转导系统通过形成死亡信号诱导复合物激活了caspase介导的细胞凋亡途径,抑制了细胞生存通路,最终引起了乳腺癌细胞的凋亡。pCMV-TRAIL-EGFP对人胚肺成纤维细胞的增殖有抑制作用,并能诱导其凋亡,而phTERT-TRAIL-EGFP对人胚肺成纤维细胞的增殖和凋亡没有影响,说明其具有肿瘤靶向性。本研究的创新之处在于,成功构建了hTERT启动子调控的TRAIL真核表达质粒（phTERT-TRAIL-EGFP）和转录活性强的CMV启动子调控的TRAIL真核表达质粒（pCMV-TRAIL-EGFP）,并在国内首次研究了其对于乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231的诱导凋亡作用,证实了hTERT启动子具有与强效CMV启动子同样的转录活性,能特异性诱导乳腺癌细胞凋亡,而对人胚肺成纤维细胞的增殖和凋亡没有影响。并研究了重组质粒抑制乳腺癌细胞增殖、诱导其凋亡的可能机制,国内外未见相关报道。本研究为乳腺癌的特异性基因治疗提供了新的思路。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写单词表
• 第一篇 前言
• 第一章 人端粒酶逆转录酶HTERT 在肿瘤治疗中的研究进展
• 1 hTERT 基因和蛋白的结构
• 2 hTERT 的表达调控
• 3 hTERT 蛋白的功能
• 3.1 维持端粒长度和端粒结构
• 3.2 促进细胞增殖和生长
• 4 hTERT 启动子在肿瘤靶向性基因治疗中的作用
• 4.1 hTERT 启动子的肿瘤特异性
• 4.2 hTERT 启动子与自杀基因的治疗
• 4.3 hTERT 启动子与肿瘤的溶瘤病毒治疗
• 4.4 hTERT 启动子与肿瘤的抑癌基因治疗
• 第二章 TRAIL 及其受体在乳腺癌中的研究进展
• 1 TRAIL 及其受体在乳腺癌表达与预后的关系
• 2 TRAIL 与其他治疗方法联合治疗乳腺癌
• 2.1 TRAIL 与化疗
• 2.2 TRAIL 与放射治疗
• 2.3 TRAIL 与内分泌治疗
• 2.4 TRAIL 与Her-2 为靶点的靶向治疗
• 第二篇 PCMV-TRAIL 及PHTERT-TRAIL 真核表达载体的构建
• 第一章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 引物
• 2 方法
• 2.1 TRAIL 基因的获取
• 2.2 重组载体pCMV/EGFP-TRAIL 的构建
• 2.3 端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子的获取
• 2.4 重组载体phTERT/EGFP-TRAIL 的构建
• 2.5 重组表达载体pCMV
• 第二章 实验结果
• 1 TRAIL 目的基因的扩增
• 2 重组载体pCMV/EGFP-TRAIL 的构建
• 3 端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子的获取
• 4 重组载体phTERT/EGFP-TRAIL 的构建
• 第三章 讨论
• 第三篇 PHTERT-TRAIL 表达载体诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 及MDA-MB-435 凋亡作用的研究
• 第一章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 细胞株
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 乳腺癌MDA-MB-231 和MDA-MB-435 细胞的培养
• 2.2 乳腺癌MDA-MB-231 和MDA-MB-435 细胞的转染
• 2.3 脂质体2000 介导乳腺癌细胞转染最佳质粒/脂质体比值的确定
• 2.4 MTT 法检测细胞增殖变化
• 2.5 细胞凋亡检测
• 2.6 细胞凋亡相关因素的研究
• 3 统计学分析
• 第二章 实验结果
• 1 乳腺癌MDA-MB-231 和MDA-MB-435 细胞的转染
• 2 MTT 实验检测不同处理组对细胞增殖的抑制作用
• 3 重组载体对乳腺癌MDA-MB-231 和MDA-MB-435 细胞凋亡的影响
• 3.1 流式细胞技术对凋亡的检测
• 3.2 TUNEL 染色检测细胞凋亡
• 4 细胞凋亡相关因素的研究
• 4.1 RT-PCR 检测凋亡相关蛋白mRNA 表达变化
• 4.2 Western blot 检测凋亡相关蛋白表达变化
• 第三章 讨论
• 第四篇 PHTERT-TRAIL 表达载体对人胚肺成纤维细胞WI38 诱导凋亡作用的研究
• 第一章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要溶液的配置
• 1.4 细胞株
• 2 方法
• 2.1 人胚肺成纤维细胞WI38 的培养
• 2.2 人胚肺成纤维细胞WI38 的转染
• 2.3 MTT 法检测细胞增殖变化
• 2.4 细胞凋亡检测
• 2.5 细胞凋亡相关因素的研究
• 第二章 实验结果
• 1 MTT 法检测人胚肺成纤维细胞WI38 的增殖变化
• 2 流式细胞技术对凋亡的检测
• 3 细胞凋亡相关因素的研究
• 3.1 RT-PCR 检测凋亡相关蛋白mRNA 表达变化
• 3.2 Western blot 检测凋亡相关蛋白表达变化
• 第三章 讨论
• 第五篇 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT