Nrf2参与子宫内膜浆液性癌发病及耐药机制的研究

论文摘要

子宫内膜癌是女性生殖道常见恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年升高趋势。子宫内膜癌根据组织病理学、发病机制、生物学行为分为两种类型,即Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型癌以子宫内膜浆液性癌为主,发病率占子宫内膜癌的10%-15%,其病情发展迅速,缺乏有效的早期诊断技术,且生物学行为恶劣,对化疗药物不敏感,因此,相对Ⅰ型子宫内膜癌而言,子宫内膜浆液性癌预后差,死亡率高。在以往大量研究的基础上,Zheng等提出EmGD为子宫内膜浆液性癌的癌前病变,同时还发现了形态学正常的p53印记细胞。在由静止期子宫内膜到进展期浆液性癌的发展过程中,p53突变、HER2/neu的过表达等分子生物学改变参与并促进了肿瘤的进展。Erythroid-E2-related factor 2 （Nrf2）是一种重要的核转录因子,可通过调节一系列下游基因的表达来维持细胞内氧化还原平衡,同时还可将有毒物质及外来药物代谢排除体外。因此,Nrf2有保护机体对抗许多慢性疾病及肿瘤的作用。近年来更多的研究发现,Nrf2与肿瘤的发生发展有着密切联系,同时Nrf2的高表达是许多肿瘤化疗耐药的促进因素。基于以上的临床及基础方面的发现,我们开展了Nrf2与子宫内膜浆液性癌发病及耐药机制的研究：第一部分Nrf2在子宫内膜浆液性癌及其癌前病变中的表达研究背景和目的：子宫内膜浆液性癌作为Ⅱ型子宫内膜癌的主要组织病理学类型,其预后明显比Ⅰ型内膜癌差,原因主要归结于其癌变机理不甚清楚及缺乏有效的诊断标志物。Nrf2是一重要的维持氧化还原平衡的核转录因子,近年来发现其在肿瘤组织及细胞中表达明显升高,同时Nrf2在肿瘤发生的初始阶段也起到了重要作用。基于这些研究我们认为Nrf2的持续激活及过表达可能是子宫内膜浆液性癌的发生过程中的促进因素之一。在本研究中,我们主要检测了包括良性子宫内膜、癌前病变及不同类型子宫内膜癌在内的子宫内膜标本中Nrf2蛋白的表达水平,并根据结果分析Nrf2在不同的子宫内膜标本中的表达差异以及这种差异能否作为一种新的子宫内膜浆液性癌的诊断性标志物,同时丰富我们对子宫内膜浆液性癌发生机制的认识与探索。材料和方法：我们用免疫组织化学的方法检测了231例子宫内膜标本中的Nrf2蛋白水平,其中良性子宫内膜作为对照共28例,癌前病变81例,浸润性癌122例。另外,20例新鲜子宫内膜组织及子宫内膜癌细胞系（Ishikawa和SPEC-2）用Western blot对Nrf2的表达进行了进一步验证。结果：Nrf2在41例子宫内膜浆液性癌中阳性率为68%（28/41）,远高于子宫内膜样腺癌（6%,p<0.001）和透明细胞癌（13%,p=0.001）。在两型子宫内膜癌的癌前病变中,子宫内膜腺体发育不良（EmGD）和浆液性子宫内膜上皮内癌（EIC）的Nrf2表达率为40%和44%,与Ⅰ型癌和透明细胞癌的癌前病变中Nrf2阳性率相比有显著差异。结论：Nrf2的过表达与子宫内膜浆液性肿瘤的发生发展紧密相关。Nrf2表达水平的变化是子宫内膜浆液性癌形成过程中的一早期事件。Nrf2的过表达有望作为子宫内膜浆液性癌的诊断标志物。第二部分Nrf2与子宫内膜浆液性癌化疗耐药的关系研究背景和目的：虽然子宫内膜浆液性癌发病率仅占所有子宫内膜癌的10%--15%,但由于早期诊断率低、进展快、化疗耐药等原因预后差,死亡率高。因此,如何改善子宫内膜浆液性癌对化疗药物的敏感性成为术后关乎治疗效果与预后的重要一环。Nrf2与肿瘤关系的研究证实,过表达的Nrf2促进了肿瘤化疗耐药的发生,且Nrf2水平与肿瘤对药物的敏感性成反比。这已在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等细胞系中得到验证。因此,我们通过体外实验研究了Nrf2表达变化对子宫内膜浆液性癌化疗耐药的影响,并在动物试验进行进一步的验证和探索。材料和方法：1.用实时定量PCR和Western的方法分别检测Ishikawa和SPEC-2细胞（Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌细胞系）中Nrf2和其下游基因如NQO1等的mRNA及蛋白水平,同时MTT法检测两种细胞对不同浓度的顺铂和紫杉醇的敏感性。2.通过瞬时转染Nrf2 siRNA的方法下调Ishikawa和SPEC-2细胞中Nrf2的水平,稳定转染的方法下调SPEC-2细胞的Nrf2水平,实时定量PCR和Western法检测稳转的spec-2细胞Nrf2及其下游基因的mRNA和蛋白水平,MTT法检测两种细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性变化。3.将分别稳定表达Keap1 （Nrf2抑制基因）和空载体的SPEC-2细胞皮下接种于免疫缺陷小鼠,定期腹腔注射顺铂并记录肿瘤体积。肿瘤组织切片进行Nrf2免疫组化染色,冻存新鲜组织用于Western法检测Nrf2及下游基因蛋白的表达,比较不同组之间肿瘤大小重量和Nrf2的表达变化。结果：1SPEC-2细胞中Nrf2蛋白水平显著高于Ishikawa细胞,其下游基因NQO1、MRP2等的mRNA水平也高于Ishikawa细胞。同样浓度的顺铂和紫杉醇作用下SPEC-2细胞存活率显著高于Ishikawa细胞。2.瞬转后Ishikawa和SPEC-2细胞的Nrf2水平明显下降,SPEC-2细胞在顺铂和紫杉醇作用下细胞存活率下降,稳定转染Keap1基因的SPEC-2细胞在顺铂作用下的MTT结果与瞬转一致。3.动物模型中Keap1+组其肿瘤大小和重量均低于空载体组且Keap1+组顺铂治疗前后其肿瘤重量的差异大于空载体组。免疫组化和Western的方法显示,空载体组Nrf2在用药后略有升高,而Keap1+组Nrf2水平在顺铂作用后反而降低。结论：Nrf2过表达是子宫内膜浆液性癌化疗耐药的重要促进因素。特异性抑制Nrf2将是子宫内膜浆液性癌生物治疗的新靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 Nrf2在子宫内膜浆液性癌及其癌前病变中的表达研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 第二部分 Nrf2参与子宫内膜浆液性癌化疗耐药的机制研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文Ⅰ
• 英文论文Ⅱ
• 中文综述
• 参考文献