封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析

论文摘要

龋病是人类最常见的牙齿疾病,引起牙体硬组织的进行性破坏。龋病的发生、发展与口腔生态系中的微生物等密切相关。唾液作为口腔微生物的储存库和转运媒介,像一把“双刃剑”与龋病的发生有着密切的联系,作为牙齿的外环境,一方面唾液在增强牙齿的抗龋能力方面起到重要的作用,另一方面唾液为细菌在口腔中的定植提供良好的生态环境和营养从而对龋病的发生有一定的促进作用。口腔中不同的微环境（牙齿、唾液、唇、舌、颊粘膜、腭粘膜等）具有不同的微生态特点,国内外已开始对菌斑生物膜及粘膜软组织的微生物构成进行分析,尚缺乏对唾液微生物分布的整体认识,而唾液微生物构成在龋病病因研究和防治中的重要意义是不容忽视的。封闭人群因其居住环境、生活方式、饮食结构、遗传背景相对固定一致,微生物在感染性疾病病因中占有更主导的位置、可比性更强,目前以封闭人群为对象进行口腔微生物整体构成和疾病发生的研究未有报道。目的：本研究使用人类口腔微生物DNA微阵列（The Human Oral Microbe Identification Microarray, HOMIM）对封闭人群牙菌斑来源的同批少数民族儿童唾液样本进行检测,通过唾液中微生物分布的高通量检测,与牙菌斑微生物组成进行比较和综合分析,以全面整体地认识口腔中不同部位微生物多样性、口腔微生态整体环境（牙菌斑和唾液）和龋病发生的相关性；同时通过实时荧光定量PCR对相同唾液样本中变异链球菌、远缘链球菌、口腔链球菌、乳酸杆菌、内氏放线菌等公认致龋菌进行检测,旨在对实时荧光定量PCR定量方法反映微生态环境中不同微生物构成作出客观的初步评价。方法：样本分别取自30个高龋儿童和20个无龋儿童的唾液,提取唾液总DNA,行165rRNA特异性序列片段PCR扩增,产物经荧光素Cy3-dCTP标记后与基于16SrRNA寡核苷酸探针所制备的HOMIM杂交,专用软件处理数据；应用SYBR Green I模式的荧光定量PCR检测唾液中变异链球菌,口腔链球菌,远缘链球菌,乳酸杆菌,内氏放线菌。使用聚类分析、秩和检验及卡方检验等结果进行统计学分析。结果：DNA微阵列分析发现（1）高龋组和无龋组共50名受试者唾液样本中共检测到94个荧光带分别归属于6个门类,30个属。高龋组个体唾液微生物种型或类群数量（中位数33）高于无龋组（中位数25）,差异有统计学意义（P<0.05）；（2）一些菌属和细菌在高龋组中的检出率或数量高于无龋组（P<0.05）,如拟杆菌（Bacteroidetes[G-2] sp clone AU126ot274）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga granulosa and sp clone BB167ot325、Capnocytophaga sputigenaot775）、梭杆菌属（Fusobacterium periodontiumot201、Fusobacterium nucleatum ss nucleatum and animalisot420698）、普雷沃菌属（Prevotella loescheii and sp clone GU027ot472）、坦纳菌属（Tannerella sp clone BU063ot286）、心肝菌属（Cardiobacterium hominisot633）、弯曲菌属（Campylobacter showaeot763、Campylobacter Cluster Iot580748763）、新月形单胞菌属（Selenomonas infelix and sp clones EY047 and GT010 and IK004ot126479481639O54）、纤毛菌属（Leptotrichia hofstadi1ot224、Leptotrichia buccalis and goodfellowii and Sneathia sanguinegensot563837845）; （3）一些菌属和细菌在无龋组中的检出率或数量高于高龋组（P<0.05）,如嗜血杆菌属（Haemophilus parainfluenzaeot718W79）挛生菌属（Gemella haemolysansot626K63、Granulicatella elegansot596AB29）链球菌属（Streptococcus intermediusot644、Streptococcus mitis bv2 and sp clone FP064ot069398、Streptococcus oralis and sp clones C5MLM037 and EK048ot064707、Streptococcus sp clone FO042ot067、Streptococcus infantis and sp clone FN042ot065638）、罗氏菌属（Rothia dentocariosaot587）。（4）远缘链球菌、乳杆菌、内氏放线菌在高龋和无龋组中均无检出,变异链球菌和唾液链球菌在高龋组中仅检出1例。（5）和牙菌斑分析结果比较：①相同无龋个体菌斑微生物的多样性（中位数39）高于唾液（中位数25）（P<0.05）；相同高龋个体唾液微生物的多样性（中位数33）与菌斑（中位数30）相近（P>0.05）。②牙周梭杆菌（Fusobacteriumperiodontiumot201R20）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）在唾液和菌斑中的检出水平均表现高龋组高于无龋组（P＜0.05）。③拟杆菌（Bacteroidetes[G-2] sp clone AU126ot274X57）、昭和弯曲杆菌（Campylobacter showaeot763X35）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga sputigenaot775W46）在无龋组牙菌斑中检出水平高于高龋组（P＜0.05）,而唾液检出则是高龋组高于无龋组（P＜0.05）。④高龋组相同个体菌斑和唾液细菌检出率或量比较：婴儿链球菌（Streptococcus infantis and sp clone FN042ot065638Y74）在菌斑的检出高于唾液（P＜0.05）,而坦纳菌属（Tannerella sp clone BU063ot286T83）、昭和弯曲杆菌（Campylobacter showaeot763X35）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga sputigenaot775W46）、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae）、梭杆菌属（Fusobacterium）则均在唾液高检出（P＜0.05）；⑤无龋组相同个体有22个菌和属在牙菌斑的检出率或数量高于唾液P＜0.05),如生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga sputigenaot775W46）、昭和弯曲杆菌（Campylobacter showaeot763X35）、戈登链球菌（Streptococcus gordoniiot622F49）等；而唾液检出率或数量高于唾液的仅有5个,即链球菌属（Streptococcus sp clone FO042ot067）、溶血挛生球菌（Gemella haemolysansot626）、苛养颗粒链菌（Granulicatella elegansot596）、缓症链球菌（Streptococcus mitis bv2 and sp clone FP064ot069）、龋齿罗斯菌（Rothia dentocariosaot587）;⑥一些细菌在所检出率较高（大于80%）,如高龋组唾液及菌斑中的中间链球菌（Streptococcus intermediusot644）、颊纤毛菌（Leptotrichia buccalis and goodfellowii and Sneathia sanguinegensot563837845）,无龋组唾液及菌斑中’的颗粒二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophaga granulosa and sp clone BB167ot325）、奈瑟菌属（Neisseria ClusterⅡot014609682764）、牙周梭杆菌（Fusobacterium periodontiumot201）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum ss nucleatum and animalisot420698）、链球菌簇（Streptococcus ClusterⅡot071758）。荧光实时定量PCR分析发现（1）变异链球菌,口腔链球菌,远缘链球菌,乳酸杆菌,内氏放线菌在所有样本中均可检出。（2）变异链球菌,远缘链球菌,内氏放线菌在高龋中多于无龋,口腔链球菌,乳酸杆菌在无龋中多于高龋,但差异均无统计学意义（P＜0.05）。结论：封闭人群高龋状态下唾液的微生物多样性增加,龋病的发生与某些细菌相关（如牙周梭杆菌、具核梭杆菌）,变异链球菌、乳杆菌、远缘链球菌等公认致龋菌可能并不是龋病发生必须的初始病原菌；相同个体的不同微环境（唾液和菌斑生物膜）微生物构成不同,无龋状态下菌斑微生物种类较唾液丰富,但龋病发生时菌斑和唾液的细菌构成和分布可能相近。口腔微生态由多个不同的微环境（其中包括牙菌斑和唾液）构成,其中不胜枚举的各种微生物相互作用、复杂分布,尚有很多细菌和龋病发生中的微妙作用需要进一步探索,如拟杆菌、昭和弯曲杆菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌等,仅靠某一种细菌在唾液（或菌斑）中的检出水平或（和）毒力高低以判断龋易感性可能比较局限,多种细菌的演替和综合作用才是龋病发生的最终机制,本研究支持菌斑生态学说。荧光实时定量PCR检测通过拷贝放大可检出群体中含量微小的个体,但缺乏DNA微阵列整体全局的客观性和可比性。

论文目录

• 主要英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验一
• 材料和方法
• 结果
• 实验二
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢