论文摘要
胚胎种植及胎盘形成是胚胎与母体之间协同作用的精细而复杂的生理过程。妊娠的成功与否直接取决于胎盘的建成和维持，滋养层细胞迁移和侵袭母体子宫组织和螺旋动脉的过程是胎盘建成的重要事件。正常情况下需要细胞外基质酶学降解、血管生成和滋养层细胞分化等共同协调作用而完成母胎界面处的物理环境变化，多种生长因子、细胞因子和激素等共同作用通过调节细胞滋养层细胞的增值和分化以确保滋养层侵入局限在一定的时间和空间内。滋养层细胞侵入过度和不足都能引起一些妊娠疾病，如绒癌、先兆子痫和宫内胎儿生长抑制等。随着胚胎的植入与发育，母胎界面发生一系列复杂而精细的生理变化。研究发现人着床前早期胚胎和滋养层细胞均分泌多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），提示MMPs在母胎对话中发挥了极其重要的作用。MMPs是蛋白水解酶的成员之一，是一类结构相关，催化活性依赖Zn2+、Ca2+的蛋白水解酶家族，通过水解胶原，糖蛋白以及蛋白多糖等多种细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分，参与细胞粘附、迁移、增值、分化以及胚胎发育着床等过程，是参与ECM降解的关键酶，也是滋养层细胞侵袭行为调控的关键因素，在胚胎着床和胎盘形成过程中发挥重要作用。MMPs／TIMPs之间的比例作为一种指标用以衡量滋养层细胞的侵入程度。一些在胎盘形成中发挥重要作用的激素，可调节MMPs活性，以介导滋养层细胞的粘附、迁移、侵入等过程。因此母胎界面之间MMPs／TIMPs的动态平衡对于重建基质和控制侵入是很关键的。促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing-hormone，GnRH）是由下丘脑神经元分泌的十肽氨基酸，是一种关键的神经调节物质。以脉冲式分泌刺激垂体促性腺细胞分泌LH和FSH，从而调节性腺内配子形成和激素功能。体内GnRH的氨基酸稳定性差，人工合成的九肽化合物，其化学结构与GnRH极为相似，称促性腺激素释放激素类似物（gonadotropin-releasing-hormone-analog，GnRHa），它包括GnRH激动剂（GnRH agonist）及GnRH抑制剂（GnRH antagonist）。本课题使用的GnRH激动剂—醋酸亮丙瑞林，是下丘脑GnRH的高活性九肽氨基酸类似物。其促LH释放活性约为GnRH的100倍，抑制垂体—性腺系统功能的作用也强于GnRH。此外，它比GnRH有更强的对蛋白分解酶的抵抗力和对GnRH受体的亲和力，能有效抑制垂体—性腺系统的功能。学者们相继发现人的胎盘中也有GnRH的分泌，并逐渐认识它不仅在维持妊娠方面有重要作用，而且对生殖激素有调节作用。前期研究已证明下丘脑分泌的GnRH与丘脑外其他组织中分泌的GnRH在免疫、生理、生化等特性方面相同。GnRH及其受体广泛分布于神经、内分泌、生殖、免疫和消化系统中，是这些系统中相互联系的重要信使之一。中枢神经系统，GnRH作为神经递质和调质发挥作用，在周围组织中，它可作为自分泌或旁分泌因子起作用。妊娠早期，胎盘就能够分泌高浓度的GnRH，是调节HCG合成和分泌的主要调节剂。细胞滋养层细胞和合体滋养细胞都表达GnRH受体mRNA，GnRH在妊娠各期的分泌呈规律变化。在妊娠妊娠早期呈平行增长的趋势，这与HCG的分泌平行，说明GnRH和HCG之间存在密切关系，表明GnRH对胎盘的HCG的合成与释放有调节功能，提示GnRH在妊娠中特别是在维持早期胚胎过程中发挥了重要作用。HCG与LH在分子结构和功能上类似。滋养细胞能分泌合成GnRH，同时也表达GnRH受体。研究发现在体外培养的恒河猴胚胎、老鼠胚胎以及人胚胎的植入过程都产生和分泌GnRH。甚至在桑椹期囊胚阶段就已经开始分泌GnRH。在人子宫内膜和蜕膜组织中也了发现GnRH的结合位点。体外实验提示GnRH本身不同的脉冲频率和剂量对GnRH受体的表达呈现不同的作用，同时雌激素、抑制素、激活素A增加GnRH受体的表达水平，孕激素减低GnRH受体的表达水平。少数几个IVF中心在早期胚胎培养液中添加GnRH激动剂，发现胚胎质量提高、胚胎着床率和妊娠率增加。结果提示，GnRH可能在人胚胎种植和胎盘形成过程中起重要的调节作用。以往的研究提示GnRH激动剂在胚胎种植和胎盘形成过程中对MMPs的表达有影响。迄今为止，GnRH在这些组织中生物学功能仍不清楚。本课题利用Luminex液相蛋白芯片技术从蛋白水平，分析GnRH激动剂对人早孕蜕膜基质细胞和绒毛外滋养细胞MMPs（MMP-1、-2、-3、-7、-9）的表达影响，探讨GnRH在胚胎着床和早期妊娠建立过程中的调节作用。第一部分GnRH激动剂对人早孕蜕膜基质细胞多种基质金属蛋白酶表达的影响目的研究GnRH激动剂对人早孕蜕膜基质细胞（decidualized stromal cells，DSC）MMPs（MMP-1，-2，-3，-7和—9）表达的影响，以探讨GnRH在人胚胎着床和早期妊娠建立过程中的调节作用。材料和方法1收集人早孕6-9周蜕膜组织10例进行离体培养，用0.25％胰蛋白酶，温和消化蜕膜组织。消化完毕后以等体积的10％胎牛血清终止消化，过滤离心。用1.5％-3％BSA纯化蜕膜细胞，去除成纤维细胞、巨噬细胞等。将同批来源的细胞分为4组，按4×105／ml接种于24孔培养板，加入含10％小牛血清的FD完全培养液培养24h后首次换液，清除未贴壁的蜕膜细胞及红细胞，再培养24h后收集上清液。2 GnRH激动剂处理蜕膜基质细胞。一组更换1mlFD培养液作为对照组，其余三组分别加入0.1 nm GnRH激动剂，1 nm GnRH激动剂和10 nm GnRH激动剂各1ml，培养24h，收集各组上清液准备测定。3倒置显微镜下观察细胞生长状态，镜下拍照。4免疫组化鉴定细胞纯度将无菌盖玻片置于培养皿中进行蜕膜基质细胞爬片培养，待细胞爬片基本长满时，取出盖玻片，PBS漂洗5min，4％多聚甲醛4℃固定30 min，以链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶（streptavidin-peroxide，SP）染色法进行染色，第一抗体分别为波形蛋白，加酶底物DAB、H2O2显色，光学显微镜观察，阳性细胞的细胞质呈棕黄色。用PBS代替一抗做阴性对照。5利用Luminex液相蛋白技术检测蜕膜基质细胞MMP-1，-2，-3，-7和-9的表达6所得计量资料以Mean±SD表示，用SSPS 13.0软件包处理数据，用重复测量方差分析（ANOVA for repeated measurement）及双变量相关分析统计数据，P＜0.05差异有统计学意义。结果1体外培养蜕膜基质细胞的特征蜕膜基质细胞在接种30min后贴壁，培养的形态为梭形或多角形，胞浆薄而透明，核仁居中。培养1周左右延伸为长梭形，相互平行排列成束。原代培养细胞约7—12d长满融合。2免疫组化鉴定蜕膜基质细胞结果蜕膜基质细胞波形蛋白染色阳性可见细胞质内有大量棕黄色颗粒，细胞纯度在95％以上，生物学特性得以维持，可以用来实验。3蜕膜基质细胞MMPs的表达特点及GnRH激动剂对它们的调节蜕膜基质细胞表达这五种MMP，以MMP-1，-3的高表达为主，其中MMP-1，-3，-2，-7和-9的表达依次降低。4 GnRH激动剂对蜕膜基质细胞多种MMP蛋白表达的影响4．1不同浓度GnRH激动剂均能上调蜕膜基质细胞MMP-1，-2，-3，-7，-9的蛋白表达，10nm GnRH激动剂上调MMPs表达的作用最为显著，1nm GnRH激动剂的上调作用其次。各浓度组之间有显著性差异（P＜0.001），重复测量方差分析GnRH激动剂各浓度（0.1nm，1nm和10nm）之间均有显著性差异（P＜0.001），组内效应（F=29988.7，P＜0.001），提示不同浓度GnRH激动剂之间的差异有统计学意义；组间效应（F=2165.7，P＜0.001），说明五种MMP之间的差异有统计学意义。4．2从图1—3发现，随着GnRH激动剂浓度的增加，除MMP-9的曲线趋于水平外，其他四种MMP的表达曲线成上升趋势。5蜕膜基质细胞对照组与试验组相关性分析。各浓度GnRH与对照组之间成正相关，相关关系显著，且关系密切（0.814≤r≤0.997 P＜0.001）。结论1人早孕蜕膜基质细胞表达MMP-1，-2，-3，-7和-9，以MMP-1，-3高表达尤为显著2 GnRH激动剂（0.1nm、1nm、10nm）能上调人早孕蜕膜基质细胞MMP-1，-2，-3，-7和-9的蛋白表达并成浓度依赖性。10nm GnRH激动剂的上调作用最为显著，1nm GnRH激动剂的上调作用次之。3 GnRH激动剂能调节蜕膜基质细胞MMP-1，-2，-3，-7和-9的表达，提示GnRH通过影响MMPs的表达，从而在胚胎种植过程中发挥重要的调节作用。4 Luminex液相蛋白芯片分析技术，能同时检测到同一样本多个极微量的分子蛋白，比其它的检测方法具有更多优势。第二部分GnRH激动剂对人早孕绒毛外滋养细胞多种基质金属蛋白酶表达的影响目的研究GnRH激动剂对人早孕绒毛外滋养细胞（extravillous cytotrophoblasts，EVCT）多种基质金属蛋白酶（MMP-1，-2，-3，-7和-9）表达的影响，以探讨GnRH在绒毛外滋养细胞侵袭母体过程和早期妊娠建立过程中的调节作用。材料和方法1收集人早孕6-9周绒毛组织10例进行离体培养，0.125％胰酶消化，过滤，1.5％-3％BSA梯度纯化绒毛外细胞滋养层细胞，将同批来源细胞分为4组，按4×105／ml接种在24孔培养板，1mlFD培养液培养48h后收集上清液。2倒置显微镜下观察细胞生长状态，镜下拍照。3 GnRH激动剂处理EVCT。一组更换1mlFD培养液，其余三组分别加入0.1nmGnRH激动剂，1nm GnRH激动剂和10nm GnRH激动剂培养液各1ml作为实验组，培养24h后收集各组上清液准备测定。4利用Luminex液相蛋白技术检测EVCT5种MMP（MMP-1，-2，-3，-7和-9）蛋白表达的变化。5所得计量资料以Mean±SD表示，用SSPS13.0软件包处理数据，用重复测量方差分析（ANOVA for repeated measurement）及双变量相关分析进行统计分析，P＜0.05差异有统计学意义。结果1体外培养EVCT的特征：体外培养2h后EVCT后可贴壁，由最初的卵圆形逐渐伸展成纺锤形、星形、多角形，EVCT可迁移、聚集，但不融合，基本不增殖。2 EVCT免疫组化鉴定：角蛋白阳性结果为EVCT细胞膜表达有棕褐色颗粒，用于实验的EVCT细胞纯度大于95％。3体外培养EVCT中MMPs的表达及GnRH激动剂对它们的调节。3．1 EVCT表达这五种MMP，以MMP-2、-9、-7、-3、-1的表达依次降低，其中MMP-2和MMP-9为高表达。3．2 0.1nm GnRH激动剂，1nm GnRH激动剂和10nm GnRH激动剂均能上调EVCT中MMP-1，-2，-3，-7，-9的蛋白表达，10nm GnRH激动剂的上调作用最明显，1nmGnRH激动剂次之。重复测量方差分析GnRH激动剂各浓度间均有显著性差异（P＜0.001），组内效应（F=29988.7，P＜0.001），提示GnRH激动剂不同浓度间差异有统计学意义，组间效应（F=2165.7，P＜0.001），说明五种MMP之间的差异有统计学意义。3．3从图2—3中发现，MMP-2和MMP-9的曲线随GnRH激动剂浓度的增加成上升趋势，而MMP-1，-3，-7的曲线趋于水平。4滋养层细胞对照组与试验组相关性分析。各浓度GnRH激动剂与对照组之间成正相关，相关关系显著，且关系密切（0.926≤r≤1.000 P＜0.001）。结论1人早孕绒毛外滋养层细胞表达五种MMP，以MMP-2，MMP-9，MMP-7，MMP-3，MMP-1的表达依次降低，其中MMP-2和MMP-9高表达尤为显著。2 GnRH激动剂（0.1nm．1nm，10nm）均能以浓度依赖方式上调人早孕绒毛外滋养细胞MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7和MMP-9的蛋白表达，10nm GnRH激动剂对五种MMP的上调作用最高，1nm GnRH激动剂次之。3 GnRH可以通过影响MMPs的表达调节绒毛外滋养细胞侵袭能力，从而在胚胎种植和妊娠建立过程中发挥重要的调节作用。