真菌感染的流行病学分析及主要病原真菌检测方法的研究

论文摘要

本研究收集假丝酵母感染患者标本及相关资料进行流行病学分析,并对分离的病原菌进行药物敏感性研究;建立了微卫星PCR、实时荧光定量PCR、PCR-纳米金标记-微孔板杂交三种方法,用于临床常见假丝酵母及曲霉的检测。流行病学分析结果表明,标本主要来源于呼吸内科（61.2%）;以痰标本的真菌分离率最高（82.8%）;分离出的病原菌中白假丝酵母所占比例最高（72.2%）;感染人数以60岁以上老年人居多（83.7%）。白假丝酵母仅对伊曲康唑表现为耐药,耐药率为1.4%,但药物依赖性敏感率高达34.4%。本研究利用三种微卫星单一引物,建立了检测假丝酵母的微卫星方法,对209株临床假丝酵母进行鉴定,根据特异性带型,能鉴别白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母,该方法简单实用,具有较好的特异性、稳定的多态性。本研究基于真菌COⅠ、COⅡ基因序列,首次设计丝状真菌通用引物;对测序获得的曲霉COⅠ、COⅡ基因序列进行比对,曲霉COⅡ基因序列具有一定的种间变异性及较高的种内稳定性,选择COⅡ基因用于真菌的检测。本研究对所获得的23种曲霉和假丝酵母COⅡ基因序列进行比对,设计特异性引物,建立检测烟曲霉和白假丝酵母的Real-time PCR方法。结果表明所设计引物特异性强、敏感性高、可对靶DNA进行定量分析,该检测方法的灵敏度为1×102copies/μl。本研究基于23种曲霉COⅡ基因序列,设计烟曲霉、黒曲霉及土曲霉的种特异性探针,通过5’端巯基修饰进行纳米金标记,建立了PCR-纳米金标记-微孔板杂交检测方法。可特异性检测烟曲霉、黒曲霉及土曲霉,对靶DNA的最低检测浓度为0.01pg/μl。利用靶DNA浓度在0.01pg/μl～1000pg/μl和吸光度值之间具有一定的线性关系,可对靶DNA进行半定量分析,结果可直接观察亦可通过检测吸光度值进行客观评价,该方法可同时检测多个样本,为临床样本的高通量检测奠定基础。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 真菌感染现状
• 1.1.1 真菌感染的病原真菌种类及特点
• 1.1.2 真菌感染的治疗与耐药现状
• 1.2 真菌感染的检测方法研究进展
• 1.2.1 PCR 技术为基础的方法
• 1.2.2 PCR 技术与其他技术结合的方法
• 1.2.3 DNA 探针技术
• 1.2.4 DNA 指纹分析为基础的方法
• 1.2.5 DNA 芯片为基础的方法
• 1.3 纳米金粒子在医学检验中的应用
• 1.3.1 纳米金粒子及特点
• 1.3.2 生物分析化学检测中常用的标记物
• 1.3.3 纳米金粒子在免疫分析中的应用
• 1.3.4 纳米金粒子在DNA 检测中的应用
• 1.4 本研究目的意义和主要内容
• 1.4.1 目的意义
• 1.4.2 研究内容
• 第2章 真菌感染的流行病学分析及药物敏感性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 临床真菌感染的流行病学分析
• 2.2.2 临床分离假丝酵母的药物敏感性分析
• 2.3 讨论
• 第3章 微卫星标记用于临床假丝酵母的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 SSR-PCR 反应体系的优化及反应条件的确立
• 3.2.2 SSR 引物用于临床假丝酵母的鉴定
• 3.3 讨论
• 第4章 实时荧光定量PCR 检测方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 丝状真菌通用引物的设计及测序结果分析
• 4.2.2 Real-time PCR 检测方法的建立
• 4.3 讨论
• 第5章 PCR-纳米金标记-微孔板杂交检测方法的建立
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 纳米金粒子、纳米金标记探针的制备及表征结果分析
• 5.2.2 纳米金标记探针的有效性验证
• 5.2.3 PCR-纳米金标记-微孔板杂交检测方法的建立
• 5.3 讨论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢