海洋微藻的分离及鉴定方法的初步研究

论文摘要

海洋微藻是海洋生态系统中的最主要初级生产者,也是海洋生物资源的重要组成部分,具有种类多、数量大、繁殖快等特点,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。同时,微藻本身营养丰富,富含人类必须的蛋白质,氨基酸、不饱和脂肪酸、多糖、类胡萝卜素等生物活性物质,在基础生物学研究、水产养殖、新能源的开发、药物研制等领域具有重要开发价值。我国海洋微藻资源丰富,已记录的近2000种。近年来,随着陆地资源的衰竭,丰富的海洋微藻资源成了人们关注的热点,从海洋中获取更多高值的微藻品种成为一项重要的基础性工作。微藻的鉴定及分类是藻类研究的基础,也一直是较为困难的课题之一。传统的微藻鉴定方法主要依赖于显微镜对微藻形态结构的观察和一些藻体所固有的生理生化特性。但是对于微微型的藻类,其可以识别并用于描述和物种鉴定的形态学特征非常少,与近缘种之间的差异非常不明显。在普通光学显微镜下,很难确定其准确的分类地位。分子生物学方法由于操作容易和结果直接可靠,被广泛的用于微藻的分类鉴定和系统进化研究中。通过选择有代表性的序列片段作为分类标准,来区分不同生物间,同种生物种内株系之间的遗传差异就成为当前研究的主要方向,为微藻的鉴定工作提供了一个新的有效方法。通过涂平板的方法,从青岛近海分离得到一株海洋微藻。通过普通光学显微镜观察,同时结合扫描电子显微镜和透射电子显微镜进行制片观察,并测定其18S rRNA基因（rDNA）序列来确定其准确的分类地位。将获得的18S rDNA与GenBank上已经登录的序列进行BLAST比对,结果显示,其序列与微拟球藻属的一个种: Nannochloropsis gaditana完全一致。进化树分析显示,该藻株与所有的N.gaditana株系聚为一支,而与其他的种区别开来。因此,推测该藻株可能为微拟球藻属的一个种: N.gaditana。Hibberd（1981）确定了微拟球藻属的分类地位,目前命名的有7个种。该属主要分布于海洋环境中,淡水和半咸水中比较少见。由于其能积累较高水平的高不饱和脂肪酸而具有较好的工业应用前景,同时被广泛的作为能量食物用于育苗中。该属所有的种都很微小,长椭圆形,直径约2微米,在形态学特征上几乎没有区别。这些藻超微结构也非常简单,通过光学显微镜和电子显微镜也难以区别。其分类主要通过18S rDNA和ITS序列分析。本研究利用18S rDNA和ITS序列分析了分离自不同地方的6株微拟球藻,并分析了它们之间的亲缘关系。结果显示:所有的藻株的序列与NCBI登录的N.oceanica一致,而与其他的种类区别开来,认为该六株藻为N.oceanica的不同株系。ITS分析显示,编号为C146和编号为Cdl的亲缘关系较近,在全部613个碱基中,两者的碱基差异为零,为同一个序列。另外的四个株系的亲缘关系较近,与第一组拥有10个相同的变异位点。某些株系拥有一到两个个别差异位点,证实了ITS变异位点的丰富性。位于两个ITS区的5.8S区的总长度为160bp,在六个株系中没有变化,显示出其保守性。这六株微拟球藻中,两两之间核苷酸差异大小为0%-2.4%。根据前人的研究成果,这六个株系可能为微拟球藻的同一种的不同株系。故18S rDNA和ITS分析的结果是温和的。普通的光学显微镜,由于放大倍数和分辨率的限制,对于微拟球藻等微型,同时又不具有特征性的表面结构的藻类,很难准确鉴定。由于分子生物学分类方法是以核酸序列的差异为依据,而核酸序列遗传的稳定性非常高,几乎不受环境条件的影响,使得结果的准确性非常高。18S rDNA和ITS序列分析,为那些通过形态鉴定难以确定分类地位的微型海洋藻类进行分子鉴定提供了一种较好的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言 综述-海洋微藻的分离及鉴定研究进展
• 1 海洋微藻的分离
• 1.1 海洋微藻的分离方法及优缺点
• 2 海洋微藻的鉴定
• 2.1 传统的鉴定方法
• 2.2 传统方法的优缺点
• 2.3 其他鉴定方法概述
• 2.4 分子鉴定的原理
• 2.5 分子鉴定的优缺点
• 2.6 海洋微藻鉴定的研究进展
• 3 本论文研究的目的和意义
• 第一章 一株海洋微藻的分离和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 分离方法
• 1.2 观察实验
• 1.2.1 光学显微镜观察
• 1.2.2 透视电子显微镜观察
• 1.2.3 扫描电子显微镜观察
• 1.3 分子鉴定分析
• 1.3.1 DNA 提取
• 1.3.2 目的片段的扩增
• 1.3.3 序列分析和进化树的构建
• 2 结果
• 2.1 观察实验结果
• 2.2 分子鉴定结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 微拟球藻的分子鉴定及结果分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DNA 的提取
• 1.2.2 目的片段的扩增
• 1.2.3 18S rDNA 和 ITS 分析
• 2 结果
• 2.1 DNA 提取效果比较
• 2.2 微拟球藻的ITS 分析
• 3 讨论
• 第三章 总结与展望
• 1 工作总结
• 2 工作展望
• 参考文献
• 附录 I f/2 培养基
• 致谢
• 个人简历