论文摘要
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）在感染肝细胞中极易发生基因片段的整合从而导致病毒在机体内长期存在不易被清除,如今已经成为世界性难题。目前关于乙肝及其所致肝癌的发病机制还不是很明确。但已有研究证实,HBV感染所致肝细胞凋亡失衡在乙肝患者肝细胞损伤及其乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。TNF相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是继FasL之后被发现、命名的肿瘤坏死因子家族新成员。TRAIL区别于TNF家族其他凋亡分子的突出特点是可特异性诱导肿瘤细胞或病毒感染细胞凋亡,而不影响正常组织细胞的功能。现有的研究表明,TRAIL诱导的凋亡在机体清除巨细胞病毒（CMV）、脑心肌炎病毒（ECMV）等多种病毒感染细胞的过程中发挥重要作用。那么关于TRAIL在HBV的致病过程,及其在HBV相关肝癌中的作用机制至今尚不清楚。HBV病毒包含4个开放读码框架（open reading frame,ORF）,这些读码框架往往以基因片段的形式整合入肝细胞内,分别编码出相应的病毒蛋白。根据HBV感染这一特性,我们课题组提出HBV全基因组、各个基因片段所编码的病毒蛋白是否对TRAIL诱导的凋亡发挥作用呢?这些作用的后果是否造成了乙肝患者的病情不同转归呢?经过研究,我们首次提出HBV全基因组、HBx蛋白、截短型中蛋白（Truncated middle surface proteins,MHBs（t））能够上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡,并且发现HBV全基因组、HBx蛋白通过上调凋亡通路分子Bax表达发挥上调机制。那么,截短型中蛋白（MHBs（t））上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡的机制是什么呢?另一关键性基因区段编码蛋白HBV核心抗原蛋白（HBV core antigen,HBc）在TRAIL诱导凋亡发挥怎样的作用呢?在前期研究基础上,本课题率先开展了有关HBV核心抗原对TRAIL凋亡的影响及其分子机制的研究和截短型中蛋白上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡的机制研究,并取得了一定的研究成果。目的:1.探讨HBV核心抗原（HBcAg）对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制的研究。2.探讨截短型中蛋白（MHBs（t））上调TRAIL诱导肝细胞凋亡的分子机制。方法:1.HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响1.1包含HBc基因真核表达载体的构建设计、合成针对HBc基因的特异性引物,以pUC19/3HBV（adr亚型）为模板,PCR扩增获得相应的基因片段。PCR反应产物经酶切定向克隆入真核表达载体pcDNA3.0内,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得阳性重组子,并被分别命名为pcDNA-HBc。1.2稳定表达HBc蛋白肝癌细胞模型的建立pcDNA-HBc及空载体对照pcDNA3.0以阳离子脂质体介导的方式分别转染肝癌细胞BEL7402,SMMC7721。经G418筛选4周后,获得阳性细胞克隆。传代扩增,获得稳定细胞株,并分别命名为BEL7402-HBc、BEL7402-pcDNA3,及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR分别检测HBcmRNA的表达,Western blot检测HBc蛋白质的表达。1.3尾静脉高压注射建立HBc在体内肝细胞表达模型BALB/c小鼠通过尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,免疫组织化学检测小鼠肝组织内HBc的表达,HE染色,血清ALT水平检测肝脏炎症。1.4 HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响细胞模型检测:不同浓度TRAIL分别作用BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc:SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞,24h后CCK-8法检测不同浓度TRAIL对各组细胞的生长抑制情况,确定最佳作用浓度。以10ng/mL TRAIL作用于BEL7402各组细胞,24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;caspase 3活化水平检测试剂盒检测caspase 3活化水平。以100ng/mL TRAIL作用于SMMC7721各组细胞,24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸,TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。另外,TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,TUNEL原位标记法检测各组小鼠模型肝切片中肝细胞凋亡情况。TUNEL流式细胞术检测各组小鼠模型肝细胞凋亡率。2.HBc的表达影响TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平:细胞模型检测:半定量RT-PCR分别检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc;SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞中TRAIL受体mRNA水平的表达,Western blot、流式细胞术检测各组细胞TRAIL受体蛋白质水平的表达。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,分别通过免疫组织化学、流式细胞术以及Western blot检测各组小鼠模型中DR5蛋白水平的表达情况。临床标本检测:取110例慢性乙肝病人血清,分别检测血清中乙肝病毒核心抗原阳性率和血清中sDR5表达。免疫组化检测慢性乙肝患者肝穿刺标本免疫组化检测DR4、DR5的表达。2)胞浆凋亡通路水平细胞模型检测:Western blot分别检测10ng/mL TRAIL作用24h后,BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞procaspase3、8、9,Bid的表达水平。RT-PCR、Western blot检测各组细胞Bax、FLIP的表达水平。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,Western blot检测各组小鼠肝细胞Procaspase 3,8,9及其Bid的表达。3)基因转录水平HBc对DR5启动子活性的影响:BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞中同时转染DR5启动子的报告质粒pDR5PF。48h后,采用双荧光素酶报告基因（Dual Luciferase Reporter,DLR）检测系统检测荧光素酶活性。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究稳定转染细胞BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc经Trizol法提取总RNA。经RNA纯化与质检,质检合格后RNA送检进行芯片实验。4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制Western blot检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞中ERK2的磷酸化水平。PD98059抑制ERK2磷酸化以后:TUNEL流式细胞术检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞在TRAIL作用下的凋亡情况;Western blot检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞中procaspase 3、8、9表达情况。结果:1.HBc的表达下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡1.1成功构建pcDNA-HBc真核表达载体以pUC19/3.0HBV为模板,PCR成功扩增HBc基因片段,酶切、连接构建重组载体,并成功转化宿主菌,经Ampr抗性筛选、酶切鉴定、DNA序列分析获得阳性重组质粒pcDNA-HBc。1.2成功建立稳定表达HBc的肝癌细胞模型pcDNA-HBc或pcDNA3.0转染肝癌细胞BEL7402、SMMC7721获得稳定细胞株,分别命名为BEL7402-HBc、BEL7402-pcDNA3及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR及Western blot可在细胞中检测到HBc mRNA和蛋白的表达。1.3尾静脉高压注射法成功建立HBc在体内肝细胞表达模型尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四中不同质粒组合。48h后,免疫组织化学法可检测到小鼠肝组织内有明显的HBc的表达,而在对照组肝组织未检测到表达。HE染色结果显示,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组比pcDNA-HBV1.1注射组炎症反应的程度明显降低。血清ALT水平检测显示pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc组ALT值明显低于pcDNA-HBV1.1（P＜0.01）。1.4 HBc的表达下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡细胞模型检测CCK-8检测结果显示,相同浓度TRAIL作用下,BEL7402-HBc细胞较对照组细胞的生长抑制率明显降低,当作用浓度为10ng/mL时,差异最为显著,因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。同样,SMMC7721-HBc细胞较对照组细胞的生长抑制率明显降低,当作用浓度为100ng/mL时,差异最为显著,因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。TUNEL流式细胞术结果显示,10ng/mL和100ng/mL TRAIL分别BEL7402-HBc和SMMC7721-HBc细胞后,与对照组细胞相比凋亡率明显降低（P＜0.01）。化学底物显色实验结果显示,在10ng/mLTRAIL作用下,BEL7402-HBc的caspase 3活化水平明显低于对照组（P＜0.01）。同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸,TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。TUNEL结果显示,反义封闭HBc后,BEL7402-HBV1.1细胞的凋亡率明显上调（P＜0.01）。另外,BEL7402-HBx细胞中转染HBc后,凋亡率明显下调（P＜0.01）。动物体内模型检测TUNEL原位标记法显示:pcDNA-HBV1.1注射组肝细胞显示凋亡的绿色荧光强且密集,而pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组凋亡信号明显减弱。TUNEL流式细胞术显示,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组肝细胞凋亡率显著低于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。2.HBc的表达下调TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平:细胞模型检测:半定量RT-PCR、real-time PCR、Western blot和流式细胞术结果显示,HBc转染组细胞和对照组细胞相比,仅DR5的表达明显降低（P＜0.01）,而TRAIL其他三个受体在mRNA水平和蛋白质水平的表达均无显著性差异（P＞0.05）。动物体内模型检测:流式细胞术、Western blot以及免疫组织化学检测DR5蛋白水平的表达,结果显示:pcDNA-HBc注射组DR5表达明显低于pcDNA3.0注射组;同样,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组DR5表达明显低于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。临床标本检测:对110例慢性乙肝病人血清中检测,结果显示:81%的患者血清中乙肝病毒核心抗原为阳性。慢性乙肝患者血清中sDR5水平明显低于正常体检人群（P＜0.01）。免疫组化检测结果显示,慢性乙肝患者肝穿刺标本DR5的表达明显低于正常对照组（P＜0.01）。2)胞浆凋亡通路水平:细胞模型检测:10ng/mL TRAIL作用下,BEL7402-HBc细胞中procaspase 3、8、9、Bid的表达水平显著高于对照组细胞（P＜0.01）。FLIP和Bax的表达无显著性差异（P＞0.05）。动物体内模型检测:Western blot检测小鼠肝组织Procaspase3,8,9及其Bid的表达结果显示,以上四个分子的表达在pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组的表达明显高于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。3)HBc降低DR5启动子活性:双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,DR5启动子相对活性在BEL7402-HBc细胞中的明显低于BEL7402-pcDNA3中（P＜0.01）。说明HBc能够明显降低DR5启动子活性。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究基因芯片结果显示:DR5表达在BEL7402-HBc细胞组明显低于BEL7402-pcDNA3细胞组。另外,综合分析结果表明,获得的差异表达基因中,35%左右的基因为癌基因或者是抑癌基因。10%左右基因与肝癌发生相关。我们选择了文献已经有明确报道的与肝癌发生相关的四个基因Sulf-2、ATIP1、LOXL1、DLC-1,进行实时定量PCR检测,结果与芯片检测结果一致。4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制4.1截短型中蛋白促进ERK2分子的活化Western blot结果显示,BEL7402-MHBs（t）细胞中可以检测到磷酸化ERK2,而对照组中均未检测到。4.2 ERK2的磷酸化是MHBs（t）上调凋亡的关键因素PD98059抑制ERK2磷酸化后,TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的肝细胞凋亡,结果显示:BEL7402-MHBs（t）细胞凋亡明显受到抑制,说明磷酸化ERK2在MHBs（t）上调TRAIL诱导肝细胞凋亡过程中起到关键作用（P＜0.01）。4.3抑制ERK2磷酸化可逆转MHBs（t）上调凋亡的的分子机制Western blot检测PD98059抑制ERK2磷酸化后对TRAIL诱导的procaspase 3、8、9活化的影响。结果显示:10ng/mL TRAIL作用下,BEL7402-MHBs（t）细胞procaspase 3、9的活化水平明显降低。从而进一步证明磷酸化ERK2在MHBs（t）上调TRAIL诱导肝细胞凋亡过程中起到关键作用。结论:1.HBc表达可降低TRAIL诱导肝细胞凋亡的敏感性,证实HBc具有抵抗TRAIL诱导凋亡的生物学活性。2.HBc的表达可通过抑制DR5启动子活性来下调DR5蛋白的表达水平,并且可降低TRAIL传导通路中procaspase 3,8,9、Bid的活化水平,而TRAIL其他受体的表达和胞浆FLIP、Bax蛋白的表达无明显变化。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究显示:HBc的表达可能与HBV相关肝癌的发生有一定的相关性。4.MHBs（t）可促使ERK2磷酸化,并且在MHBs（t）上调肝细胞凋亡过程中发挥关键作用。创新点及意义:1.本研究分别通过建立稳定转染肝癌细胞模型和硫代反义寡核苷酸封闭的方法,正、反向论证了HBV基因片段HBc在影响TRAIL诱导凋亡中的作用,并率先报道了HBc的表达可下调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,为进一步深入阐明HBV感染相关疾病的发病机制提供实验依据,为临床治疗提供新的靶点。2.本研究从TRAIL凋亡通路的胞膜受体水平、胞浆凋亡通路水平及线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径,深入探讨了HBc影响TRAIL诱导凋亡的分子机制,提出HBc可能通过调节线粒体依赖途径和非依赖途径凋亡信号的传导来影响TRAIL诱导的细胞凋亡。3.应用尾静脉高压注射法,在小鼠肝细胞内表达HBc基因,并在体内进一步证实HBc的表达可下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡,为HBc基因功能的体内研究建立了一种有价值的实验模型。4.应用双荧光报告载体系统首次提出HBc能够下调DR5启动子活性,为进一步的机制研究奠定基础。5.首次通过基因芯片的研究,提出HBc的表达与HCC发生的相关性研究是一项很有价值的研究课题。6.运用肝癌细胞模型率先报道了MHBs（t）可通过活化ERK2分子的表达,从而上调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,为MHBs（t）在肝细胞凋亡中作用机制的研究奠定基础。