一些阔叶树生斑痣盘菌科的分类和散斑壳属ISSR分子标记

论文摘要

本论文采用目前世界上较新颖、先进的分类系统和多性状综合分类方法,根据形态解剖学、个体发育学、生态及生物学等特征,对采自安徽天堂寨国家森林公园、黄山风景区和牯牛降自然保护区的斑痣盘菌科（Rhytismataceae）3属的若干种进行了分类学研究。同时,采用9个重复性好的随机引物对散斑壳属（Lophodermium Chevall.）15个菌株进行ISSR-PCR扩增反应,通过ISSR分析结果结合表型性状的比较和分析,确定了部分形态学特征以及寄主种类差异在该类真菌种水平分类上的重要性,进一步明确了散斑壳属若干种内和种间的遗传多样性和亲缘关系。以Darker（1967）的分类系统为基础,同时参考Korf（1973）、Cannon&Minter（1986）、Kirk et al.（2001）等人的若干补充和修订,对采自安徽天堂寨国家森林公园、黄山风景区、牯牛降自然保护区以及保藏于安徽农业大学森保教研室（AAUFP）的标本进行鉴定、分类。共查明隶属于齿裂菌属（Coccomyces）、散斑壳属（Lophodermium）和斑痣盘菌属（Rhytisma）3属的8个种,其中包括2个新种,即棒囊齿裂菌（Coccomycesclavatus sp.nov.）和尖孢散斑壳（Lophodermiun acutisporum sp.nov.）;并且对6个国内已知种进行了补充研究,追加了这些种的新寄主和地理新分布。以组织分离法对采自天堂寨国家森林公园的阔叶树生斑痣盘菌活材料进行分离培养,共获得隶属于齿裂菌属（Coccomyces）、皮下盘菌属（Hypoderma）、散斑壳属（Lophodermium）和斑痣盘菌属（Rhytisma）的8号分离株,接菌于MA培养基上,定期观察、记载各菌株的菌落形状、大小、色泽、结构、气生菌丝和潜生菌丝状况、生长速度、分泌色素与否以及是否产生分生孢子等特征。利用氯化苄法对采自天堂寨国家森林公园的散斑壳属（Lophodermium Chevall.）15个菌株进行DNA提取。通过对模板用量、随机引物用量、Mg2+离子用量、dNTP用量、Taq酶用量和反应退火温度及时间、延伸温度及时间、循环次数等参数进行优化,建立了该类菌物ISSR-PCR反应的最佳体系,即在15μl反应体积中,DNA模板（45ng/μl）2.0μl,随机引物（10μM）0.6μl,MgCl2（25mM）1.5μl,dNTPs（10mM）0.3μl,Taq酶（5U/μl）0.3μl,10×PCR buffer 1.5μl,ddH2O 8.8μl。扩增程序为:94℃预变性2min;每个循环94℃变性1min,特定温度下退火60s,72℃延伸2min30s,共35个循环;循环结束后72℃延伸10min。利用筛选出9条重复性好、条带清晰的引物,使用优化的ISSR-PCR反应参数及程序对散斑壳属15个菌株的DNA进行ISSR分子标记。9个引物共扩增出154个位点,其中多态性位点数150个,占总数的97.40%。扩增位点数最多的是引物S45,有21个位点数;扩增位点数最少的是S12,有14个位点数,扩增出的片断长度大多在100-2000bp之间。采用UPGMA方法构建聚类树状图,遗传距离在7.08处,15个菌株被划分为6个类群,其聚类结果与表型性状分类极其相近。通过ISSR分析结果结合表型性状的比较和分析,确定了子囊果埋生位置,子座、子囊、子囊孢子、侧丝等形态学特征以及寄主种类差异等表型性状在该类菌物分类上的重要性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 斑痣盘菌科的研究进展
• 1.2 斑痣盘菌科的形态学特征
• 1.3 斑痣盘菌科的经济性
• 1.4 几种重要、常用的 DNA分子标记技术
• 1.4.1 限制性片断长度多态性（RFLP）
• 1.4.2 随机扩增多态性 DNA（RAPD）
• 1.4.3 特征性片段扩增区域（SCAR）
• 1.4.4 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.4.5 DNA指纹技术（DNA finger printing）
• 1.4.6 简单重复序列（SSR）
• 1.4.7 单链构象多态性（SSCP）
• 1.4.8 单核苷酸多态性（SNPs）
• 1.5 分子标记技术在斑痣盘菌研究中的应用
• 1.5.1 RAPD在斑痣盘菌研究中的应用
• 1.5.2 ISSR分子标记及适用性
• 2 引言
• 3 一些阔叶树生斑痣盘菌科的分类
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 标本采集与整理
• 3.1.2 显微检查
• 3.1.2.1 外部形态观察与描述
• 3.1.2.2 切片显微检查
• 3.1.2.3 描述及拍照
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 属的特征
• 3.2.1.1 齿裂菌属
• 3.2.1.2 散斑壳属
• 3.2.1.3 斑痣盘菌属
• 3.2.2 分种检索表
• 3.2.3 种的描述
• 3.2.3.1 青冈齿裂菌 Coccmyces cyclobalanopsis
• 3.2.3.2 卷丝齿裂菌 Coccmyces circinatus
• 3.2.3.3 棒囊齿裂菌 Coccmyces clavatus sp.nov.新种
• 3.2.3.4 江南散斑壳 Lophodermium jiangnanense
• 3.2.3.5 杨氏散斑壳 Lophodermium yangii
• 3.2.3.6 尖孢散斑壳 Lophodermium acutisporun sp.nov.新种
• 3.2.3.7 喜玛拉雅斑痣盘菌 Rhytisma himalense
• 3.2.3.8 岳西斑痣盘菌 Rhytisma yuexiense
• 4 斑痣盘菌科部分种的性状培养
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料及仪器设备
• 4.1.2 菌株分离及纯化
• 4.1.3 纯培养
• 4.2 培养性状
• 4.2.1 卷丝齿裂菌 Coccmyces circinatus
• 4.2.2 安徽斑痣盘菌 Rhytisma anhuiensis
• 4.2.3 喜马拉雅斑痣盘菌 Rhytisma himalense
• 4.2.4 悬钩子皮下盘菌 Hypoderma rubi
• 4.2.5 小散斑壳 Lophodermium minus
• 5 散斑壳属一些种内和种间关系的 ISSR分子标记
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试菌株
• 5.1.2 菌丝的培养及干菌丝的获得
• 5.1.3 仪器设备及试剂配制
• 5.1.4 DNA的提取及质量检测
• 5.1.5 ISSR-PCR反应条件
• 5.1.6 ISSR扩增产物的检测
• 5.1.7 数据处理
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 ISSR扩增结果
• 5.2.2 聚类分析
• 6 结论
• 7 讨论
• 7.1 斑痣盘菌科分类中存在的问题
• 7.2 ISSR技术在生物分类中的优点及适用性
• 参考文献
• 图版Ⅰ～Ⅳ
• 致谢
• 作者简介