泰拉霉素对炎症反应的调节机制和体外抗菌后效应研究

论文摘要

泰拉霉素（Tulathromycin）为最新开发的兽用大环内酯类抗生素,有关研究显示大环内酯类可能通过非抗菌活性的免疫调节作用发挥疗效。为了解泰拉霉素是否也具有类似的活性,本文利用细菌脂多糖（LPS）诱导猪外周血单核细胞（PBMC）过度表达致炎因子而构建的体外炎症模型,采用SYBR Green法实时荧光定量PCR技术,在分子水平研究了不同浓度泰拉霉素和红霉素对一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）合成的影响。结果显示20μg/ml和10μg/ml浓度的泰拉霉素与20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml浓度的红霉素均能显著抑制猪PBMC细胞合成NO和PGE2,并抑制诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）基因的转录:而5μg/ml的泰拉霉素无明显的这种调节作用。该结果提示,泰拉霉素和红霉素可能在转录和翻译水平通过调节致炎因子的合成而发挥抗炎作用:并通过比较泰拉霉素和红霉素抗炎作用的差异,应证了14元环大环内酯比15元环大环内酯有更强的抗炎活性的推断,提示内酯环原子数目多少可能对大环内酯类药物的抗炎活性的影响更为重要。猪传染性胸膜肺炎是严重危害养猪业的重大疾病之一,其病原为猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumonia,APP）,随着抗菌药物的长期广泛使用,以往对APP有效的抗生素如β-内酰胺类、林可霉素、卡那霉素等在世界许多地方内都出现了不同程度的耐药性。抗生素后效应（Post-antibiotic effect,PAE）是近年来提出的关于抗菌药药效动力学的新理论,它的提出为抗菌药合理给药方案的设计提供了重要参数。本文在测定泰拉霉素和红霉素对猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）的最小抑菌浓度（MIC）的基础上,采用微量菌落计数法测定两种药物对APP的抗生素后效应（PAE）。结果,泰拉霉素和红霉素对APP的MIC分别为0.25～1.0μg/ml和32～128μg/ml:红霉素对APP在1/2MIC、1MIC、2MIC和4MIC浓度时的PAE分别为:0h、0.15h、0.20h和0.40h:泰拉霉素对APP在1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC和8MIC浓度时的PAE分别为:0.25h、0.62h、1.53h、2.70h和4.50h。表明受试的APP对红霉素耐药,且无明显PAE现象;而对泰拉霉素敏感,具有明显的PAE,并随药物浓度的增加,PAE增加呈浓度依赖性关系:同时在比较不同细菌接种量和不同与药物接触时间带来的PAE变化时,得出结论,PAE与接触时间呈正相关,而与细菌接种量呈负相关。研究结果提示,在使用泰拉霉素治疗猪胸膜肺炎时,适当延长给药间隔时间,减少给药次数,仍能维持抗菌效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 主要仪器和试剂
• 第一篇 文献综述
• 1 炎症与免疫
• 1.1 与炎症有关的免疫细胞
• 1.2 与炎症有关的致炎因子及其合成酶
• 1.2.1 一氧化氮（NO）和一氧化氮合成酶（NOS）
• 1.2.2 前列腺素（PG）和环氧合酶-2（COX-2）
• 1.3 与炎症有关的细胞因子
• 1.4 与炎症有关的细胞内转录因子
• 1.5 LPS与炎症因子基因转录的启动
• 2 大环内酯类抗生素抗炎症免疫调节机制研究进展
• 2.1 对白细胞等吞噬细胞功能的影响
• 2.1.1 诱导炎症相关细胞的凋亡
• 2.1.2 影响白细胞的趋化活性
• 2.1.3 抑制白细胞"氧化物爆发"
• 2的产生'>2.2 抑制致炎因子NO和PGE₂的产生
• 2.2.1 iNOS和NO
• 2'>2.2.2 COX-2和PGE₂
• 2.3 调节细胞因子的合成
• 2.3.1 对前致炎细胞因子的免疫抑制作用
• 2.3.2 对趋化细胞因子的抑制作用
• 2.4 大环内酯类抗生素作用的分子靶点（核转录因子NF-κB）
• 3 大环内酯类抗生素的抗菌活性及抗生素抗菌后效应研究进展
• 3.1 大环内酯类药物抗菌机制及发展过程
• 3.2 抗生素抗菌后效应研究进展
• 3.2.1 PAE产生的机制
• 3.2.2 PAE的研究方法
• 3.2.3 影响PAE的因素
• 3.2.4 PAE的临床意义
• 4 实验研究的目的与意义
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第一章 泰拉霉素对致炎因子的免疫调节作用
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 猪外周血单核细胞（PBMC）的分离培养
• 2.2 泰拉霉素和红霉素的毒理学评价
• 2）含量检测'>2.3 一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE₂）含量检测
• 2.3.1 NO含量的测定
• 2含量的测定'>2.3.2 PGE₂含量的测定
• 2.4 实时荧光定量PCR（real-time Q-PCR）检测iNOS和COX-2 mRNA的相对丰度
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 提取总RNA
• 2.4.3 反转录（RT）
• 2.4.4 标准品制备
• 2.4.5 实时荧光定量PCR
• 2.5 数据处理及统计
• 3 实验结果与分析
• 3.1 泰拉霉素和红霉素的毒理学评价
• 3.2 泰拉霉素和红霉素对体外LPS诱导猪PBMC细胞合成NO和iNOS mRNA的影响
• 2和COX-2 mRNA的影响'>3.3 泰拉霉素和红霉素对体外LPS诱导猪PBMC细胞合成PEG₂和COX-2 mRNA的影响
• 4 讨论
• 4.1 CCK-8法检测细胞活力
• 4.2 实时荧光定量PCR技术（real-time Q-PCR）
• 4.3 泰拉霉素和红霉素对致炎因子的免疫调节作用
• 5 结论
• 参考文献
• 第二章 泰拉霉素体外对猪胸膜肺炎放线杆菌的抗菌后效应作用
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 培养基的制备
• 2.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 2.3 体外抗菌后效应（PAE）的测定
• 2.4 PAE值的计算与数据统计分析
• 3 实验结果与分析
• 3.1 泰拉霉素和红霉素对APP的MIC
• 3.2 泰拉霉素和红霉素对APP的体外PAE
• 4 讨论
• 4.1 泰拉霉素和红霉素对APP的抗菌活性
• 4.2 体外PAE的测定方法
• 4.3 泰拉霉素和红霉素对APP的体外PAE及其影响因素
• 4.4 体外PAE和体内PAE的相关性
• 4.5 PAE与临床给药方案的设计
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 猪PBMC细胞总RNA电泳图
• 附录2 iNOS、COX-2和β-actin PCR产物电泳图
• 附录3 Real time Q-PCR标准品和样品标准曲线、扩增曲线和融解曲线