论文摘要
【背景与目的】肿瘤多药耐药（multidrug resistance,MDR）系指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时,对其他多种结构不同、作用靶位不同、作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。多药耐药（MDR）是乳腺癌化疗失败的主要原因;除外科手术外,化疗和内分泌治疗是乳腺癌治疗的主要手段。MDR的发生机制复杂,其中ATP结合盒式（ATP binding cassette,ABC）转运蛋白与耐药密切相关,这些蛋白包括P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、肺耐药蛋白（lung resistance protein,LRP）、多药耐药蛋白（multidrug resistance protein,MRP）以及它的类似蛋白MRP2和MRP3等。乳腺癌耐药蛋白（breast cancerresistant protein,BCRP）是一种新发现的ABC转运蛋白家族的成员,过表达BCRP可以导致肿瘤细胞系对米托蒽醌、拓扑替康、阿霉素等药物的耐药。人的BCRP基因定位于染色体4q22,基因跨度为66Kb,含有16个外显子和15个内含子。BCRP启动子的位置大约从-266到-36。转录起始位点上游的312bp的序列是BCRP的启动子的基本活性区域。BCRP蛋白由655个氨基酸构成,分子量大约为72KD,主要定位于细胞膜上。近来发现雌激素和雌激素的类似物有逆转BCRP介导的MDR的作用,其机制可能是作为BCRP底物,竞争性抑制BCRP与其他抗肿瘤药物结合,从而逆转由BCRP介导的MDR。而进一步研究发现,雌激素拮抗剂也有类似抑制BCRP的作用。雌激素拮抗剂是临床上乳腺癌内分泌治疗常用药物,主要通过与体内的雌激素竞争性结合癌细胞的雌激素受体,从而阻断雌激素对激素受体阳性乳腺癌细胞的生物学效应。而新近对BCRP的启动子研究发现,在BCRP基因基本启动子的上游5’端的区域具有正性和负性调控区域,并发现在BCRP启动子5’端侧翼序列上游的-243至-115之间存在一个雌激素反应元件（estrogen respond element,ERE）。该反应元件与乳腺癌细胞中BCRP的表达密切相关,因此雌激素拈抗剂也可能通过与BCRP启动子上游的ERE结合,下调BCRP基因的表达,从而逆转BCRP介导的MDR。本研究拟选择雌激素17β-雌二醇（E2）及其拮抗剂托瑞米芬（TOR）为研究对象,观察逆转BCRP介导的MDR的效果。基于此研究目的,实验拟建立分别由BCRP启动子和由巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子启动的表达BCRP的细胞系。将雌激素及其拮抗剂加入不同的耐药细胞的培养液中,观察对不同的细胞系BCRP mRNA和蛋白表达的影响和耐药逆转的效果,并探讨雌激素及其拮抗剂调节BCRP基因的作用机制,从而为逆转BCRP介导的乳腺癌MDR探寻新的途径。【方法】1.质粒的构建（1）提取人乳腺癌MCF-7细胞中的总DNA,网上查找BCRP基因启动子,采用OLIGO（Version 6.0）软件设计上下游引物;采用PCR的方法从人乳腺癌细胞系MCF-7 DNA中扩增含ERE序列的BCRP基因启动子全长。（2）提取人乳腺癌MCF-7细胞中的总RNA,根据引物设计原则和GeneBank中BCRP基因编码序列,引物分析软件自行设计上下游引物,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从人乳腺癌细胞系MCF-7 RNA中克隆出BCRP基因全长cDNA。（3）将含ERE序列的BCRP基因启动子全长和BCRP基因全长cDNA定向克隆入真核表达载体pcDNA3,经酶切筛选阳性克隆,并进一步测序鉴定。构建分别由BCRP启动子和CMV启动子启动表达BCRP的重组质粒pcDNA3-Promoter-BCRP和作为对照的质粒pcDNA3-CMV-BCRP。2.将重组质粒pcDNA3-Promoter-BCRP和pcDNA3-CMV-BCRP分别转染雌激素受体α（ERa）阳性的MCF-7和ERCα阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞系,采用新霉素筛选;建立由BCRP启动子启动表达BCRP的四种耐药细胞系MCF-7/Promoter-BCRP、MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP,并构建由CMV启动子启动的表达BCRP的细胞系做对照。采用流式细胞术、细胞倍增时间、细胞毒性实验、外排实验、RT-PCR、Western blot等方法鉴定耐药细胞系。3.将耐药细胞分别培养在含有E2或TOR的培养基中,设空白对照组。抽提耐药细胞RNA和蛋白,RT-PCR测定BCRP mRNA的表达,免疫印迹法观察BCRP蛋白的表达;米托蒽醌外排实验测定BCRP的转运功能的变化。四氮唑盐（MTT）比色法检测化疗药物米托蒽醌对耐药乳腺癌细胞的半数细胞抑制浓度（IC50）。为探讨雌激素受体在BCRP表达中的作用,实验还分别观察E2和TOR在雌激素受体阳性/阴性乳腺癌细胞中对BCRP表达的影响是否存在差异。观察E2和TOR对不同耐药细胞系BCRP表达的影响,以明确其能否在转录水平上调节BCRP基因的表达。4.凝胶阻滞实验（EMSA）分析E2或TOR和ERα的复合物与BCRP启动子上的ERE的结合,探讨其在调节BCRP介导的MDR中的作用机制。【结果】1.经BglⅡ/NdeⅠ、HindⅢ/BamHⅠ酶切鉴定,阳性质粒pcDNA3-Promoter-BCRP可以被酶切成2.4kb和0.4kb大小的两个片断。双酶切鉴定后,DNA测序证实成功构建了由BCRP启动子和CMV启动子启动表达BCRP的表达载体pcDNA3-Promoter-BCRP和作为对照的质粒pcDNA3-CMV-BCRP。2.重组质粒pcDNA3-Promoter-BCRP和pcDNA3-CMV-BCRP分别转染ERα阳性的MCF-7和ERα阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞系,建立了稳定表达BCRP的四种耐药细胞系MCF-7/Promoter-BCRP、MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP。通过流式细胞术、RT-PCR和Western blot检测,结果表明MCF-7/Promoter-BCRP、MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP细胞BCRP表达明显增加,细胞外排米托蒽醌的能力增强,BCRP mRNA和蛋白的表达水平也相应明显增加。3.E2处理组在浓度0.03nM、0.3nM、3nM时,MCF-7/Promoter-BCRP细胞中的BCRP mRNA和蛋白的表达率明显升高,分别是未处理组2.69、4.46、8.03倍和1.37、1.81、2.86倍;E2和雌激素受体拮抗剂TAM联合处理组显著低于E2单独处理组（处理前后相对BCRP mRNA表达率:61.3%±1.2%,8.5%±0.1%,P＜0.01;相对BCRP蛋白表达率:42.5%±0.8%,13.5%±0.4%,P＜0.01）,两药之间存在拮抗作用;而作为阴性对照的MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP细胞及空载体对照组,处理方法同前,各组处理前后相比,BCRP mRNA和蛋白的含量无明显改变,差异无统计学意义（P＞0.05）。4.TOR处理组在浓度0.3μM、3μM、10μM时,MCF-7/Promoter-BCRP细胞中的BCRP mRNA和BCRP蛋白的表达率明显降低,分别是未处理组27.1%、72.3%、94.0%和39.4%、64.7%、89.1%。浓度分别为0.3μM、3μM、10μM TOR和雌酮（E1）联合处理组BCRP mRNA和蛋白表达率显著低于E1单独处理组（处理前后相对BCRP mRNA表达率:194.2%±6.5%,61.7%±2.6%,25.4%±1.9%:251.3%±2.1%,P＜0.01）,处理前后相对BCRP蛋白表达率:62.9%±2.3%,58.5%±2.1%,20.7%±1.2%;136.4%±3.8%,（P＜0.01）,两药之间存在拮抗作用;而作为阴性对照的MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP细胞及空载体对照组,处理方法同前,各组处理前后相比,BCRP mRNA和蛋白的含量没有明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。5.将雌激素受体拮抗剂TOR处理耐药细胞系MCF-7/Promoter-BCRP,能显著逆转BCRP介导的MDR。米托蒽醌外排实验结果显示,MCF-7/Promoter-BCRP细胞中的米托蒽醌荧光强度显著增强,外排米托葸醌的能力降低了41.7%（处理前后相对米托蒽醌荧光强度:100%,58.3±1.4,P＜0.05）;MCF-7/Promoter-BCRP细胞对米托蒽醌IC50值由13.05±1.07μmol/L降为6.24±0.19μmol/L,耐药倍数降低52%,差异有显著性（P＜0.05）;MTT法结果显示,TOR处理组,耐药乳腺癌细胞MCF-7/Promóter-BCRP对米托蒽醌化疗药物的敏感性增加,细胞的存活率明显下降（P＜0.05）,且随着作用浓度的增加其细胞毒效应呈现明显的剂量依赖性。6.竞争抑制实验和抗体超迁移率实验结果显示,含ERα结合位点的寡核苷酸探针与MCF-7细胞核提取物的结合呈特异性,进一步证实了E2或TOR和ERα的复合物可以特异性与BCRP启动子上的ERE结合,从而调节BCRP的表达。而MDA-MB-231的细胞核提取物不能与BCRP启动子上的ERE的寡核苷酸探针结合。同时,Western blot显示MCF-7细胞表达ERα蛋白而MDA-MB-231细胞不表达ERα蛋白。以上结果说明ERα和BCRP启动子上的ERE是E2或TOR在转录水平上调控BCRP所必需的。【结论】1.构建了由含ERE序列的BCRP启动子和由CMV启动子启动表达BCRP的表达载体pcDNA3-Promoter-BCRP（含有ERE序列的BCRP基因启动子全长和BCRP基因全长cDNA）和作为对照的质粒pcDNA3-CMV-BCRP;建立了高表达BCRP的乳腺癌耐药细胞系MCF-7/Promoter-BCRP、MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP。2.17β-雌二醇明显上调ERα阳性的乳腺癌细胞中BCRP mRNA和蛋白的表达。3.托瑞米芬明显下调ERα阳性的乳腺癌细胞中BCRP mRNA和蛋白的表达,体外有效逆转BCRP介导的多药耐药。提示雌激素受体拮抗剂托瑞米芬在进行乳腺癌内分泌治疗的同时可有效逆转BCRP介导的多药耐药。4.本实验结果显示,17β-雌二醇和托瑞米芬可通过ERα介导与BCRP启动子上游的调控序列中的ERE的特异性结合,激活或抑制BCRP基因的启动子而增强或减弱BCRP的转录,从而上调或下调细胞中BCRP mRNA和蛋白的表达水平,发挥调控BCRP基因的功能作用。