基因枪法介导幼胚转NAC-43基因小麦的获得及插入位点的初步研究

论文摘要

小麦是我国重要的粮食作物之一,利用植物基因工程技术对小麦进行遗传改良,是改善小麦品质的一个重要的方法之一。小麦遗传改良的重要目标有：增强小麦抗病抗虫和耐逆境的能力,提高小麦产量,改善小麦品质。本研究以8种普通西南小麦品种作为材料,以这些小麦的幼胚作为受体诱导出愈伤组织并且研究愈伤组织的分化及再生,比较各品种间愈伤组织的诱导能力以及愈伤组织的分化再生能力,筛选小麦幼胚适宜组织培养的基因型。经过筛选之后,以小麦品种绵阳11和川农23的幼胚愈伤组织为实验材料,用基因枪法对幼胚诱导的胚性愈伤组织进行遗传转化,将重新构建好的PBI121-NAC-43表达载体转入小麦中,获得转基因植株。并且用TAIL—PCR技术对转基因阳性植株中目的基因的插入位点进行研究并对该技术进行一定的优化。获得的实验结果为：1.通过对8种小麦材料进行幼胚愈伤组织的诱导以及分化再生的研究,最后明确了大多数基因型小麦幼胚的愈伤组织诱导能力差别不是很大。而对分化再生及成苗的影响很大。利用剥胚法诱导小麦幼胚诱导出愈伤组织,并且对其进行分化和再生的培养,最终筛选出了出愈率比较高,愈伤组织的质量好,分化的能力比较强以及成苗率最高的绵阳11和川农23两个优良的西南小麦基因型材料。2.以PMD19-T-NAC-43为模板,克隆得到NAC-43基因,并将其构建到PBI121表达载体中。利用建立的小麦幼胚遗传转化体系将新构建的插入有NAC-43基因的PBI121表达载体与含有bar基因的PAHC20表达载体共转化入小麦品种绵阳11和川农23中,获得了转基因植株。并对转基因植株进行分子检测,经PCR初步鉴定,以及及回收连接转化测序后对所测序列进行比对证实目的基因NAC-43已转入其中。3.根据载体PBI121-NAC-43中左右边界的已知序列（npt和gus基因）分别设汁了3个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物,共计6个特异性引物,并按照小麦物种普遍存在的蛋白质保守氮基酸序列设计了三个简并引物,将简并引物与特异引物相互组合,进行TAIL—PCR反应,同时做了这两种引物之间加入量比例的对比研究以及二三次反应中模板稀释倍数的对比研究,从而初步优化了TAIL—PCR技术的操作并对转基因阳性植株中目的基因的插入位点进行了载体的序列分析。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 NAC转录因子的介绍
• 1.1.1 转录因子的概念
• 1.1.2 NAC转录因子的基本特征
• 1.1.3 NAC转录因子的生物学功能
• 1.2 小麦转基因技术
• 1.2.1 基因枪注射法
• 1.2.2 农杆菌介导法
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.3 在获得NAC转基因小麦的过程中所存在的问题
• 1.3.1 小麦转基因技术存在的主要问题
• 1.3.2 NAC转录因子存在的问题
• 1.4 染色体步移
• 1.4.1 染色体步移的分类
• 1.4.2 TAIL—PCR技术的原理
• 1.4.3 TAIL—PCR技术的研究进展
• 1.5 本研究的目的意义
• 2. 实验材料
• 2.1 植物材料
• 2.2 质粒
• 3. 实验方法
• 3.1 培养基的制备
• 3.1.1 诱导培养基（induce media）
• 3.1.2 分化培养基（differeneial media）
• 3.1.3 用于大肠杆菌培养的LB培养基
• 3.2 小麦组织培养体系中基因型的筛选
• 3.2.1 愈伤组织的诱导及分化
• 3.2.2 小麦再生植株的移栽
• 3.2.3 数据统计和处理
• 3.3 NAC转基因小麦的获得
• 3.3.1 表达载体的构建
• 3.3.2 基因枪法获得转基因小麦
• 3.3.3 小麦转基因植株的PCR检测
• 3.4 NAC基因插入小麦染色体位点的初步研究
• 3.4.1 植物总DNA的提取:（小麦总DNA提取）
• 3.4.2 TAIL—PCR的引物设计
• 3.4.3 TAIL—PCR产物的获得
• 3.4.4 TAIL—PCR产物的序列分析
• 4. 结果与分析
• 4.1 小麦组织培养体系中基因型的筛选
• 4.1.1 基因型对于诱导小麦幼胚的愈伤组织的影响
• 4.1.2 基因型对于小麦幼胚的愈伤组织的分化和再生的影响
• 4.1.3 出愈率、分化率以及出苗率的相关性研究
• 4.2 PBI121-NAC-43表达载体的构建
• 4.2.1 目的基因NAC-43的获得和改造
• 4.2.2 PBI121-NAC-43的双酶切
• 4.2.3 NAC-43与PBI121的连接鉴定
• 4.3 转基因植株的获得
• 4.4 转基因小麦农艺性状
• 4.5 TAIL—PCR产物的分析
• 4.5.1 TAIL—PCR产物的电泳分析
• 4.5.2 TAIL—PCR产物的序列分析
• 4.5.3 第二、三次反应模板稀释倍数的比较研究
• 4.5.4 特异引物与简并引物加入量的比较研究
• 5 讨论与结论
• 5.1 小麦组织培养外植体的选择
• 5.2 小麦基因型的局限
• 5.3 金粉及DNA用量
• 5.4 高渗处理对基因枪转化的影响
• 5.5 选择剂种类的选择
• 5.6 选择剂的浓度以及筛选时间的选择
• 5.7 TAIL—PCR反应条件的选择
• 参考文献
• 致谢
• 附录