拟穴青蟹SpToll基因的克隆、表达及其SNPs研究

论文摘要

Toll受体是一种重要的模式识别受体,在天然免疫过程中起着识别病原物并触发机体产生免疫反应的作用,被视为天然免疫向特异性免疫过渡的桥梁。目前人们已在果蝇中发现9种Toll样受体,在哺乳动物中发现13种Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）。然而迄今为止,拟穴青蟹是否具有TLRs,国内外尚无报道。为此,本研究采用分子生物学、免疫学的方法,对拟穴青蟹中的Toll样受体（SpToll）及其性质进行了深入的研究,所获研究结果具体如下:1、SpToll基因克隆及生物信息学分析采用简并PCR结合RACE技术,首次在拟穴青蟹体内发现并克隆得到Toll样受体同源基因SpTollcDNA全序列,其cDNA全长3843bp,开放读码框为3018bp,编码1006个氨基酸,预测该多肽具有信号肽和跨膜结构域,是一种跨膜蛋白。经BLAST比对,SpToll基因与多种节肢动物Toll受体蛋白高度同源,与日本对虾MjToll、凡纳滨对虾LvToll和果蝇DmToll的序列相似性分别达到43%、39%和32%。SpToll具有典型的Toll样受体结构:包括胞外富亮氨酸重复序列结构域（leucine-rich repeats,LRRs）,跨膜区和胞内TIR结构域（Toll/IL-1 receptor homologous region）,糖基化位点预测发现,SpToll胞外区有14个潜在的N糖基化位点。该研究结果证实了拟穴青蟹中Toll样受体的存在,为深入了解青蟹免疫机制奠定了良好的基础。2、SpToll mRNA组织特异性表达及病原相关分子模式研究RT-PCR分析发现SpToll基因在心、鳃、肝、胃、肠、肌肉、眼柄和血细胞中广泛表达,未发现明显的组织表达特异性。Real-time PCR研究显示,青蟹血细胞SpToll基因mRNA表达丰度在注射副溶血弧菌3h后显著下调,然后逐渐上升,至48h上调极显著,达到0h表达量的2.5倍;LPS注射3h后,该基因表达丰度相对于对照组下调极显著,至48h仍处于下调显著水平;而Poly I:C注射组青蟹血细胞SpToll基因表达丰度与对照组相比差异不显著。这预示着青蟹SpToll基因可能参与抵抗细菌类病原物入侵的免疫应答。3、SpToll LRRs区SNPs（single nucleotide polymorphisms）多态性及病原识别相关性分析为了进一步探索SpToll识别病原微生物的分子基础,我们选取SpToll病原相关分子模式识别区LRRs,采用PCR-DGGE技术、构建质粒文库结合目的基因重测序技术,进一步对其SNPs多态性及病原识别相关性进行了研究。结果发现,在SpToll基因LRRs区存在到大量的SNPs位点,平均每个个体DNA水平为55个,cDNA水平为61个,多数位点丰度较低,突变频率约为1%～4%。有意思的是,我们同时在SpToll基因胞外区LRR13的插入序列（438-451）发现一个突变率达50%以上的高频突变位点1847,其cDNA序列由A突变为G（c.1847A>G）,所编码氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸,突变类型为错义突变。经生物信息学分析,该突变可导致SpToll二级结构发生变化,提示该位点可能与SpToll特异性识别病原微生物有关。在此基础之上,进一步采用PCR产物测序技术对c.1847A>G位点不同基因型在群体中的分布规律进行了探索。结果发现,3种基因型在群体中比例相差较大,野生型（A/A）占55%,杂合型（A/G）占33%,突变型（G/G）占12%。等位基因c.1847A的频率为0.7143,c.1847G的频率为0.2857,X2检验结果显示该位点属于Hardy-Weinberg平衡状态。其群体杂合度为0.5918,PIC为0.3249,表明该基因座位属于中度多态,提示拟穴青蟹群体内遗传变异较大,该位点（c.1847A>G）有望作为一种新的分子标记用于抗逆优良青蟹的筛选。综上所述,本研究主要发现拟穴青蟹中存在Toll受体同源基因SpToll,其可能主要参与识别、抵抗细菌类病原物入侵的免疫应答。所获研究成果为阐明拟穴青蟹免疫防御机制,揭示模式识别受体低频率突变与病原微生物PAMPs高频突变的协同进化关系等奠定了良好的基础,对促进拟穴青蟹病害的免疫学防治及优良抗逆品种的筛选具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 拟穴青蟹养殖及病害研究进展
• 1.2 拟穴青蟹免疫因子研究进展
• 1.3 Toll 样受体研究进展
• 1.3.1 Toll 样受体（Toll-like receptor, TLR） 的发现及其免疫学功能研究进展
• 1.3.2 甲壳动物Toll 样受体研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.4.1 本研究的目的
• 1.4.2 本研究的意义
• 第二章 拟穴青蟹Toll 样受体的基因克隆与表达分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 细菌及培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 mRNA 反转录
• 2.2.3 简并PCR 扩增
• 2.2.4 RACE 技术
• 2.2.5 PCR 产物纯化和酶连
• 2.2.6 感受态细胞的制备
• 2.2.7 转化
• 2.2.8 阳性克隆子的鉴定及测序
• 2.2.9 生物信息学分析
• 2.2.10 Realtime PCR（SYBR GreenⅠ法）
• 2.2.11 免疫刺激
• 2.3 结果
• 2.3.1 拟穴青蟹Toll 样受体的全长cDNA 克隆
• 2.3.2 拟穴青蟹Toll 样受体基因的生物信息学分析
• 2.3.4 拟穴青蟹SpToll 基因组织表达特异性分析
• 2.3.5 免疫刺激前后拟穴青蟹SpToll 基因的表达变化
• 2.4 讨论
• 第三章 拟穴青蟹Toll 受体 LRRs 区SNPs 多态性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 基因组DNA 的提取
• 3.1.2 变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术
• 3.1.3 统计分析方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 拟穴青蟹SpToll 基因LRRs 区PCR-DGGE 结果
• 3.2.2 SpToll LRRs 区基因组DNA 水平和cDNA 水平的SNPs 比较
• G 的功能预测及遗传变异分析'>3.2.3 高频突变位点c.1847A>G 的功能预测及遗传变异分析
• 3.3 讨论
• 结论
• 附章 穴青蟹SpLRR 基因的克隆及生物信息学分析
• 参考文献
• 致谢