以新亚甲蓝为介体的电化学免疫传感器测定牛奶中的残留青霉素

论文摘要

青霉素是一类重要的β-内酰胺类抗生素，也是使用最广泛的治疗乳牛乳腺炎及其它疾病的抗生素。由于大量使用而导致的青霉素残留，既威胁着人类的身体健康又制约着我国奶业经济的发展。所以制备灵敏度高，使用方便而又经济的青霉素传感器对于保护人类身体健康是非常必要的。电化学免疫传感器利用抗原和抗体间的高度特异性结合，将传统的免疫测试方法与近代生物传感技术融为一体，既具有免疫反应的高选择性又兼有电化学分析的高灵敏性，广泛应用于医疗卫生、环境等领域。本论文以新亚甲蓝为介体，利用电聚合法和共价键合法制备成电流型青霉素免疫传感器，并就传感器的检测原理、电化学行为、检测条件的优化、影响因素以及在牛奶中的实际检测等问题作了详细地研究。具体内容概括如下：1．对新亚甲蓝（NMB）单体在溶液中的电化学行为作了探讨。选择新亚甲蓝作为中间介体是由于其具有很好的氧化还原可逆性，在中性或偏碱性溶液中属于一质子两电子反应，并在较宽的pH范围内均具有较好的电化学响应，而且该pH范围恰好为保持生物分子活性及酶的催化活性的适宜酸度范围。2．利用电聚合法将纳米金和新亚甲蓝聚合于电极表面，利用纳米金对抗体的吸附作用制备成青霉素传感器，并通过红外、紫外、扫描电镜法及电化学方法对传感器进行了表征。该传感器对磷酸缓冲溶液中青霉素响应的线性范围为0.5～6 ng／mL，检出限为0.067 ng／mL。3．利用共价键合法将辣根过氧化酶（HRP）和NMB修饰于电极表面制备成过氧化氢（H2O2）传感器，该传感器对H2O2具有响应速度快、线性范围宽、灵敏度高的特点。探讨了该传感器在0.1 mol／L磷酸缓冲溶液（pH=7.0）中的电化学和动力学性质。测得电子转移系数为0.861，表观反应速率常数为1.27 s-1。线性响应范围为2.5～100μmol／L，检出限2.07μmol／L。4．将NMB与HRP标记的青霉素抗体利用共价键合法修饰于电极表面制备成青霉素免疫传感器，并对牛奶中的青霉素进行实际检测，其检出范围为0.25～3 ng／mL，检出限为0.298 ng／mL。就抗体的纯化与标记、抗体的效价、传感器的表征、传感器的选择性、条件的优化、重现性、稳定性和影响因素等问题作了深入地探讨。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 检测牛奶中青霉素残留的意义及其进展
• 1.1 牛奶中青霉素残留检测的重要性
• 1.1.1 牛奶中抗生素的来源
• 1.1.2 牛奶中抗生素残留的现状及危害
• 1.2 牛奶中青霉素残留检测的现有方法
• 1.2.1 微生物检测方法
• 1.2.1.1 氯化三苯基四氮唑法
• 1.2.1.2 纸片法
• 1.2.1.3 管碟法
• 1.2.1.4 阻抗法
• 1.2.2 理化检测法
• 1.2.2.1 高效液相色谱（HPLC）法
• 1.2.2.2 气相色谱（GC）法
• 1.2.2.3 联用技术
• 1.2.3 免疫检测法
• 1.2.3.1 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 1.2.3.2 酶联免疫（EIA）法
• 1.2.3.3 免疫原理与其它技术联用
• 参考文献
• 第二章 电化学免疫传感器的方法原理及其应用
• 2.1 电化学免疫传感器的类型、原理及应用
• 2.1.1 电位型免疫传感器
• 2.1.2 电容型免疫传感器
• 2.1.3 电流型免疫传感器
• 2.2 固定化抗体膜的制备
• 2.2.1 包埋法
• 2.2.2 电解聚合法
• 2.2.3 共价键合法
• 2.2.4 共价交联法
• 2.2.5 自组装技术
• 2.3 电化学测试体系和检测原理
• 2.3.1 电化学测试系统
• 2.3.2 电化学测试方法及原理
• 2.3.2.1 电极过程原理
• 2.3.2.2 电化学测试方法原理
• 2.4 免疫学原理
• 2.4.1 抗体的结构和功能
• 2.4.2 抗原的性质
• 2.4.3 抗原抗体反应的特点及影响因素
• 2.4.3.1 抗原抗体结合反应的特点
• 2.4.3.2 影响抗原抗体反应的因素
• 2.5 本论文工作的意义和总体思路
• 2.6 小结
• 参考文献
• 第三章 溶液中新亚甲蓝的电化学行为研究
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 实验过程
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 循环伏安法
• 3.2.2 计时电流法
• 3.2.3 线性扫描伏安法
• 3.2.4 计时电势法
• 3.2.5 交流阻抗法
• 3.2.6 pH值对新亚甲蓝的氧化还原电位的影响
• 3.3 结论
• 参考文献
• 第四章 电聚合新亚甲蓝制备青霉素免疫传感器的研究及应用
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 仪器与试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 纳米金胶的制备
• 4.1.2.2 电聚合新亚甲蓝青霉素免疫传感器的制备
• 4.1.2.3 对青霉素标液的免疫检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 纳米金胶的电镜表征
• 4.2.2 聚新亚甲蓝（PNMB）修饰电极的聚合及表征
• 4.2.2.1 新亚甲蓝的电聚合
• 4.2.2.2 红外光谱表征
• 4.2.2.3 紫外光谱表征
• 4.2.2.4 扫描电镜表征
• 4.2.2.5 电化学表征
• 4.2.3 传感器的条件优化
• 4.2.3.1 电聚合电位的选择
• 4.2.3.2 电聚合体系的选择
• 4.2.3.3 聚合膜厚度的选择
• 4.2.4 传感器的性质研究
• 4.2.4.1 传感器的离子渗透性的研究
• 4.2.4.2 传感器对过氧化氢的响应
• 4.2.4.3 传感器对青霉素抗原响应
• 4.2.5 传感器的影响因素
• 4.2.5.1 pH值对传感器的影响
• 4.2.5.2 测试温度对传感器的影响
• 4.2.6 传感器的稳定性及重现性
• 4.3 应用与展望
• 参考文献
• 第五章:共价键合法制备以新亚甲蓝为介体的传感器的研究
• 第一节 以新亚甲蓝为介体的过氧化氢传感器的电化学行为研究
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 仪器与试剂
• 5.1.2 实验
• 5.1.2.1 玻碳电极（GCE）的预处理
• 5.1.2.2 NMB/HRP/GCE修饰电极的制备
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 NMB/HRP/GCE修饰电极的电化学行为
• 2O₂的响应机理及动力学参数的测定'>5.2.2 NMB/HRP/GCE对H₂O₂的响应机理及动力学参数的测定
• 5.2.2.1 响应机理
• 2O₂浓度的响应'>5.2.2.2 对底物H₂O₂浓度的响应
• 5.2.2.3 响应动力学参数
• 5.2.3 影响传感器的因素
• 5.2.3.1 pH的影响
• 5.2.3.2 温度的影响
• 5.2.4 重现性与稳定性
• 5.3 结论
• 第二节 以新亚甲蓝为介体的免疫传感器的初步研究
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 仪器与试剂
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 玻碳电极（GCE）的预处理
• */GCE修饰电极的制备'>5.1.2.2 NMB/Ab^*/GCE修饰电极的制备
• 5.1.2.3 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• */GCE修饰电极的电化学行为'>5.2.1 NMB/Ab^*/GCE修饰电极的电化学行为
• 5.2.1.1 修饰电极的表征
• */GCE对H₂O₂的响应'>5.2.1.2 NMB/Ab^*/GCE对H₂O₂的响应
• */GCE对mIgG抗原的免疫反应'>5.2.2 NMB/Ab^*/GCE对mIgG抗原的免疫反应
• 5.2.3 影响传感器的因素
• 5.2.3.1 pH值的影响
• 5.2.3.2 温度的影响
• 5.2.4 重现性与稳定性
• 5.3 结论与展望
• 第三节 基于新亚甲蓝介体的青霉素电化学免疫传感器的研究
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 仪器与试剂
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 青霉素多克隆抗体的制备
• 5.1.2.2 兔血清中青霉素抗体的提取与纯化
• 5.1.2.3 青霉素多克隆抗体的标记
• 5.1.2.4 ELISA测定标记后的抗体的效价
• 5.1.2.5 青霉素免疫传感器的制备
• 5.1.2.6 牛奶标液的预处理
• 5.1.2.7 对牛奶青霉素标液的免疫检测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 青霉素多克隆抗体提纯后浓度的测定
• 5.2.2 HRP标记青霉素多克隆抗体效价
• */GCE修饰电极的表征'>5.2.3 NMB/Ab^*/GCE修饰电极的表征
• 5.2.3.1 电化学表征
• 5.2.3.2 阻抗表征
• */GCE的电化学行为'>5.2.4 NMB/Ab^*/GCE的电化学行为
• */GCE对H₂O₂的响应'>5.2.5 NMB/Ab^*/GCE对H₂O₂的响应
• */GCE对青霉素抗原的免疫响应'>5.2.6 NMB/Ab^*/GCE对青霉素抗原的免疫响应
• 5.2.7 免疫传感器的条件优化
• 5.2.7.1 双官能团试剂的选择
• 5.2.7.2 共价键合反应时间的选择
• 5.2.7.3 抗体修饰时间的选择
• 5.2.7.4 修饰电极的封闭
• 5.2.7.5 抗原抗体孵育时间的优化
• 2O₂浓度的选择'>5.2.7.6 H₂O₂浓度的选择
• 5.2.8 影响传感器的因素
• 5.2.8.1 pH值的影响
• 5.2.8.2 温度的影响
• 5.2.9 传感器检测牛奶中青霉素的工作曲线
• 5.2.10 重现性与稳定性
• 5.2.11 交叉反应
• 5.3 结论与展望
• 参考文献
• 全文总结
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢