胸膜肺炎放线杆菌的STM突变体库的构建及luxS基因的结构与功能研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是引起猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的病原菌。PCP给世界养猪业带来了严重经济损失。根据APP荚膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性的不同分为15个血清型,每个血清型的流行地区和毒力有所差别。APP的主要毒力因子包括CPS、LPS、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBP）、外毒素、粘附因子、尿酶、蛋白酶等。为了对APP的致病机理进行研究,对其感染过程相关基因进行研究是非常必要的。本课题对APP的信号标签突变体库（STM）的构建以及luxS基因的结构和功能行进了研究。1.胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建STM是一种在动物体内高通量负筛选感染相关基因的技术,已经成功应用于30多种病原菌的研究。有研究者成功使用STM技术筛选了一些APP标准血清1型菌株在猪体内感染相关的基因,本实验室也已经选育了萘啶酸抗性APP菌株,并对STM突变体库的构建方法做了一定研究。在此基础之上,本研究采用双亲本结合转移（Mating）的方法,利用抗生素筛选和PCR鉴定,成功构建并保存了215个含有48个STM标签中的4个不同标签（Tag）的突变体,其中,含有Tag5的突变体保存有49个,含有Tag6的突变体保存有55个,含有Tag9的突变体保存有59个,含有Tag10的突变体保存有52个;并且对筛选过程和成功率做了总结。该库的建立对于后续的STM研究,新基因的功能研究奠定了基础。2.胸膜肺炎放线杆菌luxS基因的结构与功能研究细菌的群体感应机制是细菌之间通过某些自身或宿主分泌的信号分子的感应来实现细菌对自己行为调节的一种方式。LuxS是细菌种间群体感应系统中介导AI-2信号分子合成的酶,够调节细菌的各种行为。在本研究中,证明了APP能够合成分泌AI-2类型的分子,用同源重组的方法构建了一个luxS基因缺失的APP突变菌株,并对其生长特性,生物被膜的形成以及毒力进行了研究。与亲本菌株相比,luxS缺失突变菌株在不含血清的培养基中表现出显著的生长缺陷,同时,其生物被膜形成能力显著增强。在小鼠模型试验中,该突变菌株的半数致死量增加了96倍,并且在小鼠各组织中定植能力显著减弱。在突变菌株中,apxⅡA基因的转录水平显著下调,可能是该突变菌株毒力减弱的原因之一。本研究的结果表明,APP中的LuxS是介导AI-2分子合成的蛋白,并且LuxS能够调节APP的各种不同行为,包括生物被膜形成和毒力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎概述
• 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害
• 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的病原学
• 1.1.3 胸膜肺炎放线杆菌的致病机理研究进展
• 1.2 STM技术概述
• 1.2.1 STM技术原理
• 1.2.2 STM技术的应用
• 1.3 luxS基因的功能概述
• 1.3.1 细菌的群体感应机制
• 1.3.2 AI-2型群体感应机制
• 1.3.3 LuxS在AI-2生物合成中的作用
• 1.3.4 AI-2分子的结构
• 1.3.5 LuxS的功能基序
• 1.3.6 LuxS/AI-2的功能研究进展
• 第二章 膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建
• 2.1 目的及意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株、质粒及培养条件
• 2.2.2 酶和试剂
• 2.2.3 PCR引物
• 2.2.4 含有Tag的质粒的提取和转化
• 2.2.5 Mating法筛选突变体
• 2.2.6 突变体的鉴定
• 2.2.7 突变体库的保存
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 含有Tag质粒的提取和转化鉴定
• 2.3.2 突变体的构建和筛选鉴定
• 2.3.3 分别含有四个Tag的突变体库的构建和保存结果
• 2.3.4 突变体库的质量分析
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 胸膜肺炎放线杆菌luxS基因的结构与功能研究
• 3.1 目的与意义
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株、质粒、培养条件及PCR引物
• 3.2.2 酶和试剂
• 3.2.3 luxS基因的分析与克隆
• 3.2.4 AI-2活性试验
• 3.2.5 RNA的提取及RT-PCR方法
• 3.2.6 荧光定量PCR方法
• 3.2.7 luxS基因缺失突变体的构建
• 3.2.8 luxS基因互补菌株的构建
• 3.2.9 细菌生长特性检测
• 3.2.10 细菌生物被膜定性检测
• 3.2.11 细菌生物被膜定量检测
• 50检测'>3.2.12 细菌对小鼠的LD₅₀检测
• 3.2.13 细菌对小鼠的体内定植检测
• 3.2.14 细菌体外溶血活性检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 luxS基因在APP4074基因组中的分析
• 3.3.2 APP4074的luxS基因克隆鉴定
• 3.3.3 APP4074及克隆菌株DH5α的AI-2分子活性测定
• 3.3.4 luxS基因缺失突变体的构建及鉴定
• 3.3.5 luxS基因互补菌株的构建及鉴定
• 3.3.6 luxS基因缺失对APP4074的AI-2分子活性的影响
• 3.3.7 luxS基因缺失对APP4074生长的影响
• 3.3.8 luxS基因缺失对APP4074生物被膜形成的影响
• 3.3.9 luxS基因缺失对APP4074毒力的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 参考文献
• 致谢