论文摘要
高氧肺损伤发病机制尚未完全阐明,氧化应激反应和活性氧（reactive oxygen specie,ROS）的产生在其发生发展中扮演重要角色,线粒体是细胞活动的主要供能场所,是机体物质代谢和能量转化的中心,三梭酸循环、呼吸链电子传递及氧化磷酸化均在此进行,它是细胞内活性氧产生的主要部位和氧化损伤的靶细胞器。除了产生ATP供给细胞所需能量外,线粒体对细胞氧化还原状态和渗透压调节、钙稳态、PH维持及细胞凋亡信号传导起重要作用。随着高氧肺损伤机制研究的增多,细胞凋亡在肺损伤中作用日益得到重视,研究高氧肺损伤线粒体凋亡通路相关机制及减少其凋亡是防治新生儿肺损伤的一个新策略。目的观察线粒体凋亡通路细胞色素C（Cytochrome c,Cytc）、caspase-3在新生大鼠高氧肺损伤模型动态表达及关联,研究高氧肺损伤的线粒体凋亡通路的可能机制及意义,为进一步预防和治疗高氧肺损伤奠定实验和理论基础。方法1.新生Sprague-Dawley（SD）大鼠生后立即随机分为空气组、高氧组,每组取动物24只。高氧组持续暴露于≥95%氧气中,建立高氧肺损伤模型,空气组置于同一室内常压空气中。每组又分四个亚组,每个亚组6只大鼠。两组分别于暴露满1、2、3、4 d时取标本进行研究。2.光学显微镜观察各组新生大鼠肺组织形态学变化,透射电镜观察各组肺泡Ⅱ型上皮细胞（Alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ）超微结构变化,原位末端转移酶标记技术（TUNEL法）计算细胞凋亡指数。3.免疫印迹（Western-blot）法检测各组胞浆和线粒体内Cytc表达,免疫组化法检测caspase-3蛋白的分布和表达。结果1.光学显微镜观察各组肺组织形态学变化显示: 1d和2d的高氧组肺组织与空气组比无明显改变; 3d、4d时可见肺泡壁变薄,肺泡腔大小不均一,肺泡炎性改变:肺泡腔内可见少许死亡脱落细胞及炎症细胞渗出,肺间质水肿,小血管扩张、充血等。2.透射电镜观察AECⅡ超微结构变化示:与空气组相比高氧组AECⅡ出现不同程度板层小体空泡化,线粒体肿胀,嵴破坏,基质密度改变,甚至细胞核染色质改变,以高氧2d,3d、4d组表现明显。3. TUNEL法检测细胞凋亡结果示:空气组可见少量凋亡细胞,高氧组1 d、2d凋亡指数（%）为5.22±0.33、8.01±0.86与空气组相比无明显变化（P>0.05）;3d、4 d时其凋亡指数上升,分别为15.17±2.29、23.48±4.07与空气组相比有显著差异（P<0.01）。阳性染色主要见于AECⅡ、毛细血管内皮细胞和支气管上皮细胞。4.肺组织胞浆及线粒体细胞色素C蛋白表达的动态变化:生后第2天高氧组胞浆内Cytc蛋白相对水平为0.82±0.14,第3天为1.37±0.11,第4天为1.20±0.11,均高于相对应空气组（分别为0.23±0.04,0.24±0.03,0.24±0.02）（P均<0.01）;生后第2天高氧组线粒体内Cytc蛋白相对水平为0.72±0.04,第3天为0.41±0.06,第4天为0.23±0.05,均低于相对应空气组（分别为1.31±0.13,1.34±0.06,1.29±0.05）（P均<0.01）。5.肺组织caspase-3蛋白含量表达的动态变化水平:caspase-3免疫组化阳性染色主要表达于肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、支气管上皮和肺间质细胞胞浆中。生后第3天高氧组caspase-3灰度值为94.96±8.95,第4天为91.27±10.64均低于相对应空气组（分别为102.65±8.44,102.2±7.29）（P<0.05）。注:灰度值越低,表达越强。6.凋亡指数与肺组织Cytc蛋白、caspase-3表达的相关性:凋亡指数与胞浆Cytc蛋白表达呈正相关,r=0.58,P<0.01;凋亡指数线与线粒体Cytc蛋白表达呈负相关,r=-0.921,P<0.01;凋亡指数与Caspase-3灰度值表达呈负相关,r=-0.573,P<0.01。结论1.短时间高氧暴露可致新生大鼠肺组织产生急性肺损伤炎性表现。随着高氧暴露时间延长AECⅡ超微结构发生变化,且肺细胞凋亡指数升高。2.高氧暴露可致新生大鼠肺组织Cytc由线粒体释放至胞浆,Cytc分布发生变化,可能通过激活caspase-3进而导致线粒体途径介导的细胞凋亡,从而导致高氧肺损伤。3. Cytc释放、caspase-3表达与细胞凋亡指数及肺线粒体形态的动态变化具有相关性。