论文摘要
重症肌无力（MG）是由乙酰胆碱受体抗体（AChR Abs）介导,补体参与的自身免疫性疾病,由于其抗原、抗体明确且免疫学发病机制也相对清楚,对研究其他自身免疫性疾病的发病机制和治疗具有指导意义。抗人AChR的单链抗体（scFv）是单价抗体并且缺乏Fc段,不会引起抗原调变作用或激活补体破坏突触后膜,可以保护NMJ突触后膜的AChR免受MG患者血清中自身抗体的攻击,成为MG治疗最有潜力的靶点。以往scFv的可溶性表达多采用载体pHEN1,以带信号肽PelB的分泌型表达形式进行。尽管可以直接在胞周质或培养上清中得到可溶性scFv,然而这种方式存在可溶性蛋白产量低,纯化过程代价高的缺陷,给大量制备带来困难。本研究拟采用融合NusA标签蛋白的方式表达scFv1956#,以期得到大量可溶性的表达产物。用PCR扩增含有抗人AChR scFv1956#的载体pHEN1中scFv1956#的结构基因,并将其插入到原核表达载体pET44a（+）中。用重新构建的载体pET44a（+）-scFv1956#转化菌株BL21（DE3）pLysS和Roseta-garmi B（DE3）;同时用原有载体pHEN1-scFv1956#转化菌株HB2151和JM109,分别用两种诱导条件诱导表达:标准的1mM IPTG,37℃诱导4 h;低温25℃长时间诱导20 h。用SDS-PAGE来比较不同载体和菌株在不同温度和时间的诱导条件下scFv1956#可溶性表达的量,并通过Western blot进行鉴定。结果显示PCR产物大小为785 bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实scFv1956#核苷酸序列正确,并正确插入载体pET44a（+）。SDS-PAGE和Western blot的结果显示,新构建的载体pET44a（+）-scFv1956#在不同菌株和诱导条件下所得到的可溶性蛋白表达量均优于原载体pHEN1-scFv1956#。对于载体pHEN1-scFv1956#,换不同菌株表达或采用低温长时间的诱导方式均不能提高胞周质或培养上清中可溶性蛋白的含量;而对于载体pET44a（+）-scFv1956#,低温长时间诱导确实有助于提高可溶性表达的量,而且用菌株BL21（DE3）pLysS表达时这种趋势更为明显。用菌株BL21（DE3）pLysS表达pET44a（+）-scFv1956#, 1 mM IPTG,25℃诱导20 h,裂菌后的可溶性成分经Ni2+亲和层析柱纯化,并用凝血酶（Thrombin）切除融合蛋白上的NusA标签。Western blot的结果证实酶切后相对分子量为27 kD处的可溶性成分确实为带有c-MYC标签的蛋白。综上所述,载体pET44a（+）表达的N端融蛋白NusA可以帮助scFv1956#正确折叠,从而获得大量可溶性融合蛋白。低温长时间诱导确实能够提高可溶性融合蛋白的表达量。尽管融合蛋白需要进一步的纯化,酶切才能获得scFv1956#,但是这种融合表达的策略对于大量制备scFv1956#,以及下一步的研究和将来在分子水平治疗MG具有重要意义。
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- [1].抗猪流行性腹泻病毒纳米单链抗体CNC-CBD-scFv的制备及鉴定[J]. 中国兽医学报 2019(07)
- [2].Generation of a Canine-origin Neutralizing scFv Against Canine Parvovirus[J]. Journal of Northeast Agricultural University(English Edition) 2020(03)
- [3].Antitumor effects of an engineered and energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin[J]. Science China(Life Sciences) 2011(03)
- [4].Theoretical Design of Catalytic Domain of Abzyme Se-scFv2F3 by Introducing a Catalytic Triad[J]. Chemical Research in Chinese Universities 2010(01)
- [5].Preparation and Identification of scFv and bsFv against Transferrin Receptor[J]. Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences) 2008(06)
- [6].胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)重组单链可变片段的纯化优化[J]. 医学食疗与健康 2020(04)
- [7].scFv17改善12月龄三转基因小鼠步态的作用[J]. 中国应用生理学杂志 2018(05)
- [8].Preparation of Monoclonal Antibody Against PthA-NLS and Cloning of the Relative ScFv Gene[J]. Agricultural Sciences in China 2010(01)
- [9].丙溴磷人源ScFv抗体的筛选与鉴定[J]. 太原师范学院学报(自然科学版) 2008(02)
- [10].Novel Selenium-containing Human Single-chain Variable Fragment with Glutathione Peroxidase Activity from Computer-aided Molecular Design[J]. Chemical Research in Chinese Universities 2011(05)
- [11].Construction of non-covalent single-chain Fv dimers for hepatocellular carcinoma and their biological functions[J]. World Journal of Hepatology 2010(05)
- [12].Anti-LMP1scFv/tP融合蛋白基因递送载体在大肠杆菌中的表达与纯化[J]. 中国细胞生物学学报 2010(03)
- [13].表达CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ及CD20scFv-IgGFc T淋巴细胞的建立及其对B细胞淋巴瘤靶向杀伤作用的比较[J]. 中国病理生理杂志 2008(07)
- [14].高效构建卵清白蛋白scFv噬菌体文库及其筛选[J]. 中国生物工程杂志 2018(11)
- [15].抗鸡传染性法氏囊病病毒单链抗体库的构建及其中和抗体的筛选[J]. 中国预防兽医学报 2014(03)
- [16].抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定[J]. 中国公共卫生 2009(03)
- [17].Construction of multiform scFv antibodies using linker peptide[J]. 遗传学报 2008(05)
- [18].正交试验设计筛选scFv包涵体变性和复性工艺[J]. 中国医药工业杂志 2017(09)
- [19].抗狂犬病病毒单链抗体的筛选及鉴定[J]. 中国生物工程杂志 2013(11)
- [20].基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2013(01)
- [21].融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的构建及真核表达[J]. 中国细胞生物学学报 2010(05)
- [22].急性淋巴细胞白血病单链抗体(scFv)的筛选与鉴定[J]. 现代检验医学杂志 2016(05)
- [23].抗rhEndoglin单链抗体的可溶性表达、纯化及活性鉴定[J]. 免疫学杂志 2009(01)
- [24].酵母展示筛选scFv方法的建立[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2009(12)
- [25].Antioxidant Effect of Human Selenium-containing Single-chain Fv in Rat Cardiac Myocytes[J]. Chemical Research in Chinese Universities 2009(02)
- [26].抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达[J]. 药学学报 2009(06)
- [27].卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠HSP70融合蛋白的构建、表达及鉴定[J]. 中国医药生物技术 2008(05)
- [28].人源天然抗TNF-α ScFv抗体的筛选及性质分析[J]. 微生物学免疫学进展 2018(02)
- [29].PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定[J]. 中国预防兽医学报 2011(06)
- [30].人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2008(05)