论文摘要
目的探讨经气管插管由同轴微导管超选择定位，精确定位灌注甲基胆蒽（methylcholanthrene，MCA）、二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）超液化碘油混悬液，诱导犬肺癌模型，为肺癌深入研究提供新平台；通过X线胸片、血管造影检查与基因检测、免疫组化及病理观察，探讨肺癌早期病理变化与影像学表现的关系，为早期肺癌的影像学诊断提供理论依据：从分子生物学角度探讨抑癌基因p53、p16表达与早期肺癌之间的关系，为肺癌早期诊断提供参考指标。材料与方法实验犬年龄1—3岁，体重21—25Kg的杂种犬22只，雌雄兼有，随机将22只犬分为5组，全身麻醉，经气管插管由同轴微导管精确定位向右肺膈叶灌注致癌药物（甲基胆蒽（MCA）0.25g+二乙基亚硝胺（DEN）0.38g+超液化碘油混悬液3ml）分组：A组（4只）、B组（4只）、C组（4只）、D组（5只）、E组（5只）各组均行X线胸片动态观察，分别观察至1、3、6、12、18个月，处死A组、B组、C组、D组、E组实验犬，取注药部位肺组织，加10％中性福尔马林固定，石蜡包埋（切片厚度5μm）H·E染色，根据标本染色情况，选取结构完整标本进行后续染色观察及统计处理。对E组（观察18个月）5只实验犬行支气管动脉造影（Bronchial Arteriography，BAG）犬全身麻醉后，经右侧股动脉穿刺，采用改良式Seldinger技术，行选择性支气管动脉造影。穿刺成功后，经导丝置入导管鞘和C3导管，在胸主动脉近气管隆突附近以后、右、前、左的顺序寻找支气管动脉开口。当导管头有嵌顿、落空感，不再随心脏搏动而移动时，经导管注入少量造影剂，确定导管进入支气管动脉后，行DSA支气管动脉造影。应用高压注射器以每秒2ml的速度注入4ml造影剂，观察支气管动脉造影的表现。观察有无支气管动脉和肋间动脉共干，是否左右支气管动脉共干，支气管动脉是否增粗、变形，有无肿瘤血管及染色，是否存在其它动脉向肿瘤供血。通过DSA表现，分析在动脉期、实质期（毛细血管期）和静脉期的BAG结果，确定肿瘤的供血动脉来源、形态及肿瘤染色情况。造影结束后，肌注抗菌素预防感染。病理学检查，所有标本行HE染色，通过光镜、电镜观察灌注致癌物部位在诱发癌变过程中肺组织病理变化；采用免疫组化染色方法检测p53、p16基因表达有无异常；选取CD31血管内皮标记测定致癌部位内血管生成情况。采用病理图像分析系统对标本HE染色切片进行形态计量与分别计数方法，免疫组化染色片统计阳性细胞数。结果1．X线胸片观察：3个月时局部沉积的致癌质超液化碘油的密度较前变淡。随观察时间的延长，致癌质超液化碘油的密度逐渐变淡，范围较前缩小，可明显指示注药部位。6个月时部分犬（2只犬）在注药部位出现可疑软组织团块状影。18个月时胸片上未见明显确切的类圆形软组织团块状影。2．血管造影观察：对诱导18个月的5条犬进行支气管动脉造影，显示多数支气管动脉与肋间动脉共干，由支气管动脉向灌注致癌物区供血。支气管动脉增粗，迂曲、走行紊乱的肿瘤样血管及染色。右侧支气管动脉多为两支，分别供应不同肺叶，1只犬可见左右支气管动脉共干。3．病理观察：5只犬中4只诱导为肺癌及癌前相关损害。病理类型包括鳞癌和细支气管肺泡癌（简称肺泡癌）。鳞癌标本光镜下见胶原基质表面鳞状上皮癌变，向胶原深层呈索状侵入；于胶原表面呈腔状，内含脱落的鳞癌细胞；侵入胶原基质的鳞癌细胞，基本组织类型为多角形及梭形癌细胞。电镜下见癌细胞有大核仁，胞浆内可见张力原纤维。细支气管肺泡癌标本光镜下见肺泡癌细胞部分呈细支气管粘液腺上皮分化，腺泡癌细胞呈复层，极性丧失，腺管结构紊乱，腺腔中有共壁的癌细胞；临近组织均显有肺不张。电镜下见核大，核仁多而大，大量不整形核仁协同染色质，胞浆极少，呈多数不规则突起，细胞间连接分化不成熟。18个月时，该方法诱导肺癌及癌前相关损害成功率为80％（4／5）。4．免疫组化检测：检测p53、p16基因蛋白在灌注致癌物部位肺组织中表达呈阳性，肿瘤细胞呈棕黄色染色。P53与p16分别在1、3、6、12、18个月观察灌注致癌物部位肺癌组织基因表达，检测结果p53基因蛋白随癌变诱导时间增加，阳性表达率逐渐升高；p16基因蛋白阳性表达逐渐减低。CD31血管内皮标记表达阳性。发现异常增生血管。结论1．采用经气管插管由同轴微导管精确定位灌注甲基胆蒽、二乙基亚硝胺和超液化碘油混悬液方法，成功诱导出经病理学及分子生物学证实的近似人类原发性支气管肺癌的犬肺癌模型。2．CD31血管内皮细胞标记呈阳性，肿瘤血管异常增生，证实支气管动脉造影征象为肿瘤血管及染色。3．抑癌基因P53、p16随诱导癌变时间增加，阳性表达异常与肺癌早期发病密切相关，p53基因突变与p16基因失活是肺癌发病的重要机制，早期检测P53和P16为诊断肺癌早期指标之一，对肺癌早期诊断有重要价值及临床意义。