油松雌配子体游离核有丝分裂的细胞学研究

论文摘要

辽宁兴城油松种子园的油松（Pinus tabulaeformis Carr.）雌性不育株（28号无性系）表现为球果能正常长大,但雌配子体由于游离核有丝分裂不能继续进行而停止发育,导致胚珠败育。该不育系具有稳定的遗传特性,是研究木本植物雌配子体发育调控机制的极好材料。为进一步分析该不育系游离核停止分裂的原因,本论文在系统研究油松28号不育系游离核停止分裂前后细胞形态学和组织化学的基础上,以油松种胚为材料建立了油松悬浮细胞系,采用细胞同步化技术、流式细胞仪技术、蛋白质双向电泳技术等研究手段初步分析了油松细胞周期调控机制;并进一步利用免疫印迹、免疫组化技术探讨了细胞周期相关调控因子在游离核分裂关键时期的表达。研究结果为揭示裸子植物雌配子体发育过程中细胞周期调控因子的表达与调控机制提供了非常有价值的信息,对拓展木本植物发育生物学的研究领域,以及揭示植物雌性不育机制等都具有十分重要的意义。1.利用油松雌配子体分离、电镜观察、细胞组织化学等技术,观察比较了在游离核停止分裂前后油松11号可育系和28号不育系珠被、珠心、雌配子体及游离核的显微结构、超微结构、营养物质的动态变化。发现油松不育系雌配子体发育停止在游离核时期,该时期不育系游离核等细胞器出现异常,细胞核膨大,核仁消失,核内染色质发生汇聚、凝集,在雌配子体细胞质中含有大量的异常线粒体,其形态异常膨大或延长,内部结构模糊不清,而小液泡的数量明显减少,甚至看不到较大的液泡,并且有部分液泡膜出现凹陷或裂解。另外不育系胚珠珠心组织细胞异常加厚,多糖物质出现异常积累。2.油松悬浮细胞细胞周期的研究结果显示,处于指数生长的油松悬浮细胞用3mM HU处理24h后,细胞恢复生长3h时,90.71%的细胞被阻断于G1期,恢复生长27h时,M/A分裂指数达到最大值,并且有40%的细胞进入G2期。分析同步化处理后恢复生长3h和27h的细胞蛋白质组,发现G1期细胞特有蛋白质点11个,M期细胞新增加4个。与G1期相比,M期表达量明显上调的蛋白质点7个,明显下调的蛋白质点3个。差异蛋白质主要分布在18kDa/pI6.3-30kDa/pI7.5和60kDa/pI6.5-70kDa/pI7.2两个区域。推测这些蛋白质可能参与了不同时期细胞周期的调控过程。3. CaM和类Cyclin C蛋白在雌配子体游离核有丝分裂过程中起着重要作用。CaM,类Cyclin C蛋白在油松细胞周期过程中呈现出相似的周期性变化,即G1期含量较少,S期大量积累,到G2期CaM含量有所减少,在下一个细胞周期S期又增加,表明这些因子与油松细胞周期调控有关。CaM和类Cyclin C蛋白在油松胚珠中的分布具有时空调控特征。在游离核旺盛分裂期,珠被大细胞层中CaM的分布明显减少,而外侧珠被组织中CaM的分布明显增加,推测珠被组织可能作为产生或集散CaM的部位,通过钙（Ca2+）信号系统调控了游离核的分裂以及珠心组织细胞的降解;在雌配子体细胞化过程中,雌配子体游离核区CaM含量的增加,推测可能与游离核细胞壁的形成相关。类Cyclin C蛋白伴随着油松雌配子体游离核的旺盛分裂而表达,在败育后期不育系胚珠中类Cyclin C蛋白过度表达,推测可能参与了油松游离核有丝分裂的调控,类Cyclin C蛋白异常表达可能是影响雌配子体育性的重要因素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 高等植物雌配子体的发育及调控
• 1.1.1 高等植物雌配子体的发育
• 1.1.2 雌配子体发育分子调控的研究
• 1.1.3 雌配子体发育过程中的组织化学研究
• 1.2 植物发育的细胞周期调控
• 1.2.1 植物细胞周期调控的主要因子
• 1.2.1.1 CDKs
• 1.2.1.2 Cyclins
• 1.2.1.3 RBRs
• 1.2.1.4 参与细胞周期调控的其他因子
• 1.2.2 植物细胞周期的同步化
• 1.2.2.1 植物细胞同步化诱导的概况
• 1.2.2.2 同步化的诱导方法
• 1.2.2.3 细胞同步化的检测方法
• 1.3 钙调素与植物的生长发育
• 1.3.1 钙调素与配子体发育
• 1.3.2 钙调素与细胞增殖
• 1.4 本文研究的目的和意义
• 2 油松雌配子体游离核有丝分裂的细胞学及组织化学观察
• 2.1 雌配子体的分离及观察
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 酶解条件的建立
• 2.1.2.2 雌配子体分离技术的建立
• 2.1.2.3 雌配子体分离及观察
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 酶解最佳条件的确定
• 2.1.3.2 雌配子体的分离
• 2.1.3.3 不育系雌配子体及游离核的观察
• 2.1.4 讨论
• 2.1.4.1 雌配子体的分离
• 2.1.4.2 可育系雌配子体游离核分裂规律
• 2.1.4.3 不育系雌配子体及游离核的变异
• 2.2 雌配子体游离核有丝分裂的超微结构观察
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 珠心组织超微结构的观察
• 2.2.3.2 雌配子体超微结构的观察
• 2.2.4 讨论
• 2.2.4.1 不育系雌配子体及游离核超微结构的异常
• 2.2.4.2 珠心细胞的衰退过程
• 2.3 游离核有丝分裂的组织化学观察
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.3.1 胚珠珠被组织的发育
• 2.3.3.2 胚珠珠心组织的发育
• 2.3.3.3 胚珠中多糖、蛋白质及脂类的时空分布特征
• 2.3.4 讨论
• 2.3.4.1 胚珠发育过程中类绒毡层细胞的发育
• 2.3.4.2 不育系雌配子体珠心细胞的异常加厚
• 2.3.4.3 胚珠发育过程中营养物质的变化
• 2.4 胚珠离体培养条件下的细胞学观察
• 2.4.1 材料
• 2.4.2 方法
• 2.4.2.1 胚珠的离体培养
• 2.4.2.2 石蜡切片观察
• 2.4.3 结果与分析
• 2.4.4 讨论
• 2.4.4.1 离体培养条件下可育系胚珠的生长发育特点
• 2.4.4.2 离体培养条件下不育系胚珠的生长发育特点
• 2.4.4.3 离体培养条件下珠心、珠被等组织细胞的生长特点
• 2.5 结论
• 3 油松胚珠及种胚细胞周期的初步研究
• 3.1 油松愈伤组织诱导及悬浮细胞系的建立
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 愈伤组织的诱导
• 3.1.2.2 悬浮体系的建立和参数的测定
• 3.1.3 结果与分析
• 3.1.3.1 不同外植体愈伤组织的诱导
• 3.1.3.2 愈伤组织继代培养基的筛选
• 3.1.3.3 悬浮细胞系的建立
• 3.1.4 讨论
• 3.2 悬浮细胞的同步化
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.3 结果与分析
• 3.2.3.1 最适HU 处理浓度
• 3.2.3.2 最适HU 处理时间
• 3.2.3.3 流式细胞仪分析
• 3.2.4 讨论
• 1 期与M 期细胞蛋白质的研究'>3.3 G₁ 期与M 期细胞蛋白质的研究
• 3.3.1 材料
• 3.3.2 方法
• 3.3.2.1 实验试剂
• 3.3.2.2 溶液配制
• 3.3.2.3 仪器设备
• 3.3.2.4 蛋白质提取
• 3.3.2.5 2-D 电泳
• 3.3.3 结果与分析
• 3.3.4 讨论
• 3.4 结论
• 4 CaM 和类Cyclin C 蛋白对油松雌配子体游离核分裂影响的初探
• 4.1 CaM 对游离核分裂的影响
• 4.1.1 CaM 在悬浮细胞细胞周期中的表达
• 4.1.1.1 材料
• 4.1.1.2 方法
• 4.1.1.3 结果与分析
• 4.1.2 CaM 在游离核分裂关键时期的表达
• 4.1.2.1 材料
• 4.1.2.2 方法
• 4.1.2.3 结果与分析
• 4.1.3 讨论
• 4.1.3.1 CaM 与油松细胞周期
• 4.1.3.2 CaM 与油松游离核分裂
• 4.2 类Cyclin C 蛋白对游离核分裂的影响
• 4.2.1 类Cyclin C 蛋白在悬浮细胞细胞周期中的表达
• 4.2.1.1 材料
• 4.2.1.2 方法
• 4.2.1.3 结果与分析
• 4.2.2 类Cyclin C 蛋白在游离核分裂关键时期的表达
• 4.2.2.1 材料
• 4.2.2.2 方法
• 4.2.2.3 结果与分析
• 4.2.3 讨论
• 4.2.3.1 类Cyclin C 蛋白与油松细胞周期
• 4.2.3.2 类Cyclin C 蛋白与油松游离核分裂
• 4.3 结论
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢