论文摘要
胆管癌是起源于胆道上皮的少见的恶性肿瘤,占全部胃肠道肿瘤的3%,1840年由Durand Fardel最早报道。胆管癌的发生率为1.2/10万,2/3的病例是年龄超过65岁的老人,年龄超过80岁的老人发病率则升高10倍。肝外胆管癌起源于肝外胆道（不包括胆囊癌）,占全部胆管癌的90%-94%。我国的发病率以每年递增5%的速度上升,是消化道肿瘤中上升速度最快的肿瘤。手术治疗仍然是目前最为有效的治疗手段,但是获得根治性切除患者的3年生存率仅为35%至50%,缺乏有效的综合治疗手段。目前,一些与胆管癌转移的分子已经得到确认,其中,趋化因子越来越受到大家的关注。趋化因子是一单链小分子（8-10kD）蛋白质超家族,根据氨基末端半胱氨酸残基的位置,将趋化因子分为CC、CXC、C和CX3C四类,趋化因子能够与G蛋白偶联受体相互作用,控制肿瘤播散,促进肿瘤生长以及血管发生。CXC类趋化因子CXCL12及其特异性受体CXCR4在肿瘤发生、浸润、转移、增殖和复发中发挥重要的作用。但是,到目前为止,CXCL12-CXCR4在肝外胆管癌发生、发展中所起的作用机制目前尚未见报道。为探讨CXCL12-CXCR4在肝外胆管癌发生、发展中的作用机制。本研究进行了以下工作:1、回顾性调查肝外胆管癌的外科治疗和影响预后的因素。2、采用IHC、RT-PCR、Western blot技术研究CXCL12-CXCR4在肝外胆管癌组织中的表达及其临床病理学意义。3、采用IHC、RT-PCR技术研究CXCL12-CXCR4对肝外胆管癌浸润转移以及淋巴管形成的影响。4、研究FOXP3+ Treg细胞在肝外胆管癌中的浸润情况,分析其对诱导免疫耐受以及预后的影响。本研究论文共分为四个部分:1 161例肝外胆管癌的外科治疗和预后分析目的:探讨肝外胆管癌（Extrahepatic Cholangiocarcinoma, EHCC）的临床特征、治疗方法对远期生存率的影响及EHCC切除术后的预后因素。方法:对1995年4月至2006年7月河北医科大学第二医院收治的161例EHCC的临床特点、诊断、手术方式和随访结果进行回顾分析。选择对EHCC切除术后预后可能产生影响的临床因素,通过Cox比例风险模型进行多因素的预后分析。结果:161例手术治疗的EHCC,根治性切除110例,姑息性切除32例,引流或探查组19例。161例患者总体1、2、3、5年生存率分别为74.9%、45.3%、36.5%和11.1%。Cox分析结果表明肝脏浸润、门脉或肝动脉侵犯和淋巴结转移是EHCC根治切除影响预后的独立因素（P<0.05）。根治性切除是提高EHCC远期生存率及改善生活质量的关键,肝叶切除和（或）胰十二指肠切除联合骨骼化切除是提高根治切除率及远期疗效的重点。2趋化因子CXCL12及其特异性受体CXCR4在肝外胆管癌组织中的表达及其意义目的:探讨趋化因子CXCL12及其特异性受体CXCR4表达对肝外胆管癌临床进展和预后的影响以及相互关系。方法:分别采用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法检测CXCL12和CXCR4在82例肝外胆管癌中的表达,并对临床指标和预后进行分析。2.1肝外胆管癌中CXCL12免疫组化染色结果CXCL12表达于胞浆和胞膜,呈棕黄色。基质成纤维细胞弱表达。82例肝外胆管癌组织中,CXCL12蛋白阳性表达率为92.7%,强阳性表达率为25.6%;弱阳性率为31.7%;7例胆道良性肿瘤中CXCL12阳性表达率为57.1,无强阳性表达;12例非肿瘤胆道上皮组织中CXCL12阳性表达率为16.7%,无强阳性表达。CXCL12蛋白在肝外胆管癌中的表达显著高于胆道良性肿瘤和非肿瘤胆道上皮组织中的表达,（P<0.01）。2.2肝外胆管癌中CXCR4免疫组化染色结果CXCR4主要表达于肝外胆管癌细胞的胞浆和胞膜,细胞浆内弥散状分布。淋巴样细胞同样表达。82例肝外胆管癌组织中,CXCR4蛋白阳性表达率为75.6%,强阳性表达率为8.5%;弱阳性表达率为45.1%;7例胆道良性肿瘤中CXCR4阳性表达率为28.6%,无强阳性表达;12例非肿瘤胆道上皮组织中无CXCR4蛋白表达。CXCR4蛋白在肝外胆管癌中的表达高于胆道良性肿瘤和非肿瘤胆道上皮组织中的表达,差异显著（P<0.01）。2.3肝外胆管癌组织中CXCL12蛋白表达与临床病理特征的关系CXCL12蛋白的表达与肝外胆管癌临床进展有相关的趋势,II～IV期高于Ⅰ期的表达（42.7% vs 18.3%,P=0.068）。2.4肝外胆管癌组织中CXCR4蛋白表达与临床病理特征的关系CXCR4蛋白的表达与肝外胆管癌临床进展有相关的趋势,II～IV期高于Ⅰ期的表达（22.4% vs 7.3%,P=0.088）。2.5 CXCL12表达对肝外胆管癌预后的影响Kaplan-Meier生存曲线显示,CXCL12高表达组中位生存时间27个月,低表达组中位生存时间24个月。单因素分析检验表明,CXCL12高表达组与低表达组之间差异无显著性（P>0.05）。2.6 CXCR4表达对肝外胆管癌预后的影响Kaplan-Meier生存曲线显示,CXCR4高表达组中位生存时间27个月,低表达组中位生存时间18个月。单因素分析检验表明,CXCR4高表达组与低表达组之间差异无显著性（P>0.05）。2.7 CXCL12 mRNA在肝外胆管癌组织中的表达肝外胆管癌组织中CXCL12 mRNA的表达与淋巴结转移和临床分期密切相关,淋巴结转移组相对表达量为0.32±0.4,明显高于非转移组（0.09±0.02, P<0.05）;Ⅱ、Ⅲ期病例CXCR4 mRNA的表达明显高于Ⅰ期病例（0.50±0.15 vs 0.24±0.02, P<0.05）。CXCL12 mRNA在低分化组和高中分化组的相对表达量分别为0.23±0.09和0.10±0.01,无显著差异（P>0.05）。2.8 CXCR4 mRNA在肝外胆管癌组织中的表达半定量RT-PCR结果分析表明,肝外胆管癌组织中CXCR4 mRNA的表达与淋巴结转移和临床分期密切相关,淋巴结转移组和非转移组的相对表达量分别为0.44±0.07和0.23±0.03,淋巴结转移组明显高于非转移组（P<0.05）;Ⅱ、Ⅲ期病例CXCR4 mRNA的表达明显高于Ⅰ期病例（0.43±0.07 vs 0.25±0.08, P<0.05）。CXCR4 mRNA在不同分化程度病例中的表达无明显差异（P>0.05）。2.9 Western blot法检测CXCR4在肝外胆管癌组织中的表达采用图像分析系统对杂交条带进行定量分析表明,CXCR4蛋白在淋巴结转移组和非转移组相对表达水平分别为0.28±0.17和0.20±0.19,两者无显著差异（P>0.05）;CXCR4蛋白在低分化组和高中分化组之间及不同临床分期病例间的表达水平均无明显差异（ P均>0.05）,提示肝外胆管癌组织中CXCR4在mRNA和蛋白水平上表达的意义有一定差异。2.10 CXCL12与CXCR4在肝外胆管癌中表达的相关关系CXCL12与CXCR4之间无相关关系（r=0.095,P>0.05）;但是在II～IV期,CXCL12与CXCR4之间存在正相关关系（P=0.05）。3 CXCL12-CXCR4对肝外胆管癌浸润转移以及淋巴管形成的影响目的:探讨VEGF-C、MMP-9表达对肝外胆管癌临床进展和预后的影响以及与CXCL12的相互关系。方法:分别采用免疫组化和RT-PCR方法检测VEGF-C和MMP-9在77例肝外胆管癌中的表达,分析了其临床病理和预后意义。结果:3.1 VEGF-C在肝外胆管癌、胆管良性肿瘤、非肿瘤胆管上皮组织中的表达VEGF-C阳性表达定位肝外胆管癌细胞胞浆,呈浅黄色到棕黄色颗粒状,间质细胞无着色。非肿瘤胆道上皮组织、胆管良性肿瘤和肝外胆管癌组织VEGF-C阳性表达率和强阳性表达率分别为16.7%、0;57.1%、0和87%、18.2%,肝外胆管癌中VEGF-C的表达高于胆管良性肿瘤和非肿瘤胆道上皮组织（P<0.05）。3.2 MMP-9在肝外胆管癌、胆管良性肿瘤、非肿瘤胆管上皮组织中的表达MMP-9的阳性表达定位于肝外胆管癌细胞胞浆,呈弥漫或散在分布的棕黄色颗粒,肿瘤间质内的成纤维细胞和浸润的炎症细胞亦着色。77例肝外胆管癌组织中67例MMP-9表达阳性,阳性率为87%,其中强阳性率为7.8%,弱阳性率为36.4%;7例胆管良性肿瘤中5例阳性表达,阳性率为71.4%;12例非肿瘤胆道上皮组织阳性率为16.7%,均为弱表达。肝外胆管癌组织中MMP-9表达阳性率明显高于非肿瘤胆道上皮组织（P<0.01）。3.3肝外胆管癌组织中VEGF-C蛋白表达与临床病理特征的关系VEGF-C蛋白表达在II～IV期明显高于Ⅰ期（36.4% vs 11.7%,P<0.05）;淋巴结转移组表达明显高于非转移组（27.6% vs 21.1%,P<0.05）;低分化组表达高于高中分化组表达（P<0.01）。3.4肝外胆管癌组织中MMP-9蛋白表达与临床病理特征的关系MMP-9蛋白表达在II～IV期明显高于Ⅰ期的表达（42.9% vs 20.8%,P<0.05）。3.5 VEGF-C表达对肝外胆管癌预后的影响VEGF-C高表达组中位生存时间17个月,低表达组中位生存时间36个月。单因素分析检验表明,VEGF-C高表达组与低表达组之间差异显著（P<0.05）;多因素分析检验表明VEGF-C、淋巴结转移、门静脉和（或）肝动脉受侵是影响肝外胆管癌预后的独立影响因素。3.6 MMP-9表达对肝外胆管癌预后的影响MMP-9高表达组中位生存时间18个月,低表达组中位生存时间36个月。单因素分析检验表明,MMP-9高表达组与低表达组之间差异显著（P<0.05）;多因素分析检验表明MMP-9、淋巴结转移、门静脉和（或）肝动脉受侵是影响肝外胆管癌预后的独立影响因素。3.7 VEGF-C mRNA在肝外胆管癌组织中的表达半定量RT-PCR结果分析表明,VEGF-C mRNA在淋巴结转移组和非转移组的灰度值分别为0.24±0.03,0.17±0.05,淋巴结转移组明显高于非转移组（P<0.05）;但VEGF-C在mRNA水平上的表达在低分化组和高中分化组之间及不同临床分期之间无明显差异（P > 0.05）。3.8 MMP-9 mRNA在肝外胆管癌组织中的表达半定量RT-PCR结果分析表明,MMP-9 mRNA在淋巴结转移组的表达明显高于非转移组（0.91±0.1 vs 0.11±0.04,P<0.01）;肝外胆管癌组织中MMP-9 mRNA表达与肿瘤分化程度和临床分期密切相关,低分化组明显高于高中分化组（0.20±0.03 vs 0.08±0.02,P<0.01）;Ⅱ、Ⅲ期病例MMP-9 mRNA相对表达量（0.43±0.02）明显高于I期病例（0.23±0.02, P<0.05）。3.9 CXCL12与VEGF-C、MMP-9在肝外胆管癌中表达的相关关系经统计学分析,CXCL12与VEGF-C之间成显著正相关（r=0.259,P<0.05）;CXCL12与MMP-9之间呈显著正相关（r=0.276,P<0.05）。4肝外胆管癌中CXCL12-CXCR4的表达与FOXP3+ Treg细胞聚集的关系目的:探讨FOXP3+ Treg细胞聚集对肝外胆管癌临床进展和预后的影响以及其与相关基因表达的相互关系。方法:采用免疫组织化学方法检测FOXP3+和COX-2蛋白在肝外胆管癌、胆道良性肿瘤和非肿瘤胆管上皮组织中的表达情况。结果:4.1 COX-2在肝外胆管癌、胆管良性肿瘤、非肿瘤胆管上皮组织中的表达COX-2阳性染色定位肝外胆管癌细胞胞浆,呈浅黄色到棕黄色颗粒状,间质细胞无着色。77例胆管癌组织中63例COX-2表达阳性,阳性率为81.8%,强阳性率为22.1%,弱阳性率为29.3%;7例胆管良性肿瘤COX-2表达阳性率为57.1%,无强阳性表达;而12例非肿瘤胆道上皮组织阳性率为16.7%,均为弱表达,肿瘤组织中COX-2表达阳性率明显高于非肿瘤胆道上皮组织（P<0.01）,与胆管良性肿瘤表达阳性率无差异（P>0.05）。4.2 FOXP3+ Treg细胞在肝外胆管癌、胆管良性肿瘤、非肿瘤胆管上皮组织中的聚集FOXP3阳性染色定位于浸润淋巴细胞（TIL）细胞核,呈棕黄色。肝外胆管癌间质中存在浸润的FOXP3+ Treg细胞,计数为3.37±0.39（x±s）;胆道良性肿瘤中浸润的FOXP3+ Treg细胞数量为0.4±0.21;非肿瘤胆道上皮组织中未见到FOXP3+ Treg细胞的聚集。肿瘤间质中FOXP3+ Treg细胞的浸润显著高于胆道良性肿瘤和非肿瘤胆道上皮组织中的浸润。4.3 COX-2蛋白表达与肝外胆管癌临床病理特征的关系对比临床资料发现,COX-2的表达与肝外胆管癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期和淋巴结转移方面无差异（P>0.05）。4.4 FOXP3+ Treg细胞的聚集与肝外胆管癌临床病理特征的关系FOXP3+ Treg细胞的聚集与肝外胆管癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期和淋巴结转移与否均无差异（P>0.05）。4.5 COX-2表达对肝外胆管癌预后的影响COX-2高表达组中位生存时间27个月,低表达组中位生存时间18个月,COX-2高表达组与低表达组之间差异无显著性（P>0.05）;多因素分析检验表明COX-2的表达不是影响肝外胆管癌预后的独立影响因素。4.6 FOXP3+ Treg细胞的聚集对肝外胆管癌预后的影响FOXP3+ Treg细胞高聚集组中位生存时间14个月,低聚集组中位生存时间28个月,两组之间差异显著（P<0.05）;多因素分析检验表明FOXP3+ Treg细胞的聚集、组织学分级、门静脉和（或）肝动脉受侵是影响肝外胆管癌预后的独立影响因素。4.7 FOXP3+ Treg细胞的聚集与CXCL12、CXCR4和COX-2的相关关系经统计学分析,COX-2与Treg细胞聚集之间成显著正相关（r=0.235,P=0.039）;CXCL12与Treg细胞聚集之间无相关关系（r=-0.098,P>0.05）;CXCR4与Treg细胞聚集之间无相关关系（r=-0.173,P>0.05）。结论:1.肝脏浸润、门脉或肝动脉侵犯和淋巴结转移是EHCC根治切除影响预后的独立因素。2.根治性切除是提高EHCC远期生存率及改善生活质量的关键,肝叶切除和（或）胰十二指肠切除联合骨骼化切除是提高根治切除率及远期疗效的重点。3. CXCL12和CXCR4的表达从非肿瘤胆管上皮组织、胆管良性肿瘤到肝外胆管癌有不断增高的趋势,提示它们可能参与了肝外胆管癌的发生。CXCL12和CXCR4的表达与肝外胆管癌的临床分期、淋巴结转移密切相关。它们可能共同促进肝外胆管癌的浸润、转移过程。4. CXCL12表达与VEGF-C和MMP-9表达正相关。VEGF-C和MMP-9的表达从非肿瘤胆管上皮组织、胆管良性肿瘤到肝外胆管癌不断增高。VEGF-C和MMP-9的表达与临床分期、淋巴结转移和组织分化密切相关,是影响肝外胆管癌进展的重要因素,并且是肝外胆管癌的独立影响因素。5. FOXP3+ Treg细胞聚集与肝外胆管癌中CXCL12和CXCR4的表达无关;COX-2蛋白表达与FOXP3+ Treg细胞聚集之间存在明显的正相关。6.肝外胆管癌中存在着FOXP3+ Treg细胞的浸润,其聚集的数目显著高于非肿瘤胆管上皮组织和胆管良性肿瘤,但是,与肝外胆管癌的临床病理参数无关。其聚集的情况与肝外胆管癌的预后负相关,是影响肝外胆管癌预后的独立影响因素。7.肝外胆管癌中COX-2蛋白表达明显增高,但是COX-2蛋白表达与肝外胆管癌患者的临床病理参数以及预后无关。
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