论文摘要
根据NCBI发表的马冠状病毒（ECV）核衣壳基因序列，设计引物，采用PCR方法扩增出ECV核衣壳基因片段，并构建pGEX-ECV-N，转化宿主菌BL21，经IPTG诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，结果表明42KD的GST-ECV-N融合蛋白在大肠杆菌中获得表达。将ECV-N从pGEX-ECV-N双酶切下后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl，构建重组转移质粒pFastBac-ECV-N，并转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选出重组穿梭质粒Bacmid-ECV-N，通过转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBac-ECV-N。PCR鉴定结果表明ECV-N基因片段已经重组到杆状病毒基因组中。用鼠抗GST-ECV-N多抗对细胞表达的重组蛋白进行间接免疫荧光试验，结果出现亮绿色荧光，证明本研究构建的含有ECV-N基因的重组杆状病毒能够良好表达ECV-N蛋白。以饱和硫酸铵法提纯马IgG，免疫Balb／c小鼠，经常规方法融合，通过间接ELISA法筛选，结果获得两株抗马IgG的单克隆抗体，分别命名为EQ-IgG-3D10，EQ-IgG-666。单抗生物学特性研究表明：两株单抗均为IgG亚类，有较好的ELISA工作效价，与其他种动物血清均无交叉反应，EQ-IgG-6G6与马IgG有Western-blot反应性。利用重组病毒rBac-ECV-N感染Sf9昆虫细胞表达出的ECV-N蛋白作为抗原，以抗马IgG单克隆抗体为第二抗体，研制了检测抗ECV-N抗体的ELISA试剂盒。ELISA结果表明，当抗原包被10μg／mL细胞总蛋白，马血清1：100稀释，抗马IgG单克隆抗体用细胞培养上清，检测的特异性，灵敏性最佳。以此组成试剂盒对国内外1064份马血清检测，结果表明中国和澳大利亚马血清存在疑似、阳性血清，而瑞典马血清中没有疑似和阳性血清；中国马血清、澳大利亚马血清、瑞典马血清的阳性率分别是0.98％（即7／711）、6.87％（即23／335）和0（即0／18）。这些结果提示ECV在马群中已存在，必须加以控制。
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标签：马冠状病毒论文; 核衣壳基因论文; 原核表达论文; 真核表达论文; 抗马论文; 单克隆抗体论文; 检测试剂盒论文;