胀果甘草细胞培养及查尔酮合成酶基因的cDNA克隆

论文摘要

甘草是中国常用的中药,是重要的药用植物。除药用价值外,甘草在食品、饮料、卷烟、化妆品等工业中也广泛使用。近年来,由于人们破坏性地对野生甘草采挖,使野生植物几乎灭绝。故开展甘草组织培养工作,尤其是大规模悬浮培养具有重要意义。黄酮类化合物是甘草中一大类生物活性成分,它们具有抗溃疡、抗菌、抗炎、抗氧化、抗HIV、抗肿瘤等作用。查尔酮合成酶是所有黄酮类化合物合成的关键酶。它催化3分子的丙二酰辅酶A与1分子对羟基苯丙烯酰辅酶A缩合成柚皮素查尔酮,以此为支架其他黄酮类化合物得以衍生出来。查尔酮合成酶活性的积累与黄酮类化合物的积累是紧密相关的。本实验切取胀果甘草无菌苗的子叶、胚轴、根段3种外植体进行了愈伤组织诱导和继代培养,建立了甘草悬浮细胞培养体系,测定了悬浮培养的细胞生长曲线；并且研究了接种量、条件培养基和外源激素对悬浮细胞的影响。结果表明子叶来源的愈伤组织最适合悬浮培养；悬浮培养的最佳接种量为35g/L；条件培养基的最佳用量为总培养体积的1/3；最适合胀果甘草悬浮培养的的培养基是附加NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L激素组合的MS培养基。利用RT-PCR方法,从胀果甘草愈伤组织中克隆了查尔酮合酶基因的cDNA片断,并进行了序列分析。测序结果表明,我们克隆所得到的cDNA片段包含一个开放阅读框架,由1170bp核苷酸组成,编码一个由389个氨基酸残基组成的多肽。与紫花苜蓿、大豆、豌豆等几种豆科植物CHS基因的核苷酸同源率在80%以上,氨基酸同源率在90%以上。已将得到的序列提交GenBank/EMBL/DDBJ注册,序列号为EU706287。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 甘草的基本特征
• 1.2 甘草细胞组织培养及其次生代谢产物研究概况
• 1.2.1 植物细胞组织培养生产次生代谢产物
• 1.2.2 甘草细胞组织培养
• 1.2.3 甘草主要次生代谢产物的合成途径
• 1.2.4 甘草细胞组织培养生产其次生代谢产物的研究进展
• 1.3 甘草化学成分研究进展
• 1.3.1 甘草化学成分
• 1.3.2 甘草化学成分的分析和提取技术
• 1.4 查尔酮合成酶基因研究进展
• 1.4.1 查尔酮合成酶基因
• 1.4.2 查尔酮合成酶基因的进化
• 1.4.3 查尔酮合成酶基因的表达调控
• 1.4.4 查尔酮合成酶基因的应用
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 宿主菌株及质粒载体
• 2.1.3 实验药品
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 溶液及缓冲液
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 甘草愈伤组织诱导与继代培养
• 2.2.2 胀果甘草的细胞悬浮培养
• 2.2.3 胀果甘草查尔酮基因的克隆及序列分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 胀果甘草愈伤组织诱导与继代培养
• 3.1.1 胀果甘草无菌苗的培养
• 3.1.2 胀果甘草愈伤组织的诱导培养
• 3.1.3 胀果甘草愈伤组织的继代培养
• 3.1.4 胀果甘草愈伤组织生长发育研究
• 3.2 胀果甘草悬浮细胞培养
• 3.2.1 胀果甘草悬浮细胞
• 3.2.2 外植体来源对胀果甘草悬浮培养的影响
• 3.2.3 接种量对悬浮培养的影响
• 3.2.4 条件培养对悬浮细胞的影响
• 3.2.5 适合胀果甘草细胞悬浮培养的激素组合及浓度的筛选
• 3.3 胀果甘草查尔酮合成酶基因的cDNA克隆
• 3.3.1 胀果甘草愈伤组织总RNA提取
• 3.3.2 胀果甘草actin基因的PCR扩增
• 3.3.3 胀果甘草CHS基因的PCR扩增
• 3.3.4 目的基因片段的克隆及鉴定
• 3.3.5 胀果甘草CHS序列的测定及同源性分析
• 第四章 讨论
• 4.1 胀果甘草愈伤组织的诱导与继代培养
• 4.2 胀果甘草的细胞悬浮培养
• 4.3 胀果甘草RNA的提取
• 4.4 胀果甘草查尔酮合成酶基因的cDNA克隆
• 4.5 对今后工作的几点设想及建议
• 4.5.1 甘草细胞大规模悬浮培养条件的研究
• 4.5.2 甘草查尔酮合成酶基因植物表达载体的构建
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢