肝癌靶向单链抗体的筛选与亲和力测定

论文摘要

原发性肝癌世界上恶性程度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，其中90％以上为肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），全球每年因HCC而死亡的患者超过100万。在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位，每年至少有10万名新发现病人，和11万名肝癌病人死亡。尽管目前肝癌能够早期发现，且治疗方法有许多种，但治疗效果都十分有限，并未显著延长病人的生存期。大部分肝癌病人对化疗及放疗等治疗均不敏感，能手术根治的病人仅占15％。近年来，随着分子生物学和免疫学的不断发展，对癌基因的认识不断深入，以及转基因技术的日趋完善，肝癌基因治疗已显示出一定的前景。成为继手术、放疗和化疗之后第4种治疗模式。载体问题一直是肝癌基因治疗研究领域的核心技术之一。肝癌基因治疗常用的载体主要分两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体存在非导向性、有限的携带能力、生产和包装以及安全性的困扰等问题；近年来，非病毒载体以其安全性，低毒性，低免疫反应，靶向性及易于组装等优点被寄予厚望。其中，研究具有肝癌靶向特异性分子是需首要解决的问题，去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是肝脏的一种重要且高效的内吞受体，主要分布于肝小叶门静脉周围肝细胞的窦面膜微绒毛间隙（Microvilli Clefts），配体能否在微绒毛间有效渗透可能也是决定ASGPR介导的内吞的一个重要。肾脏的滤过的阈值是60-70kDa，单链抗体作为配体不经修饰很快从肾脏滤过。Wu等第一次利用ASGP作为配体，将DNA靶向性导入了ASGPR表达阳性的细胞（HepG2）细胞，但由于天然配体分子大、来源困难以及潜在的生物危险性，目前更倾向于通过生物工程手段获得靶向分子。至今，已证实有多种去唾液酸糖蛋白受体的配体可有效介导靶向性DNA转移至肝癌细胞。如半乳糖基多聚赖氨酸（Lac-PLL）、半乳糖基脂质体、半乳糖基聚乙烯亚胺、半乳糖化的胆固醇、醣脂类等。研究表明：scFv可以模拟配体的功能，将目的基因导入到靶细胞中，通过受体介导的内吞作用将目的基因导入靶细胞中。王骞等用抗TfR的单链抗体，将HSV-tk基因有效地导入肝癌细胞HepG2。噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高、稳定性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础。噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体（scFv）的噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体，即为噬菌体抗体库。经特定抗原或细胞筛选后，便可获得特异性抗体。本研究将利用抗体库技术，体外筛选、克隆、表达去唾液酸糖蛋白受体的单链抗体，并对单链抗体的筛选进行了改进，进一步提高筛选的阳性率，并对所获得的单链抗体进行亲和力测定，使有利于作为肝癌基因治疗的靶向分子，为其作为肝癌的基因治疗能在体内应用成为可能奠定基础。[目的]从人源噬菌体抗体库（Tomlinson I Library）中筛选与ASGPR特异性结合的单链抗体。采用捕获噬菌体ELISA法，从人源抗体库中筛选抗ASGPR的单链抗体，并与间接噬菌体ELISA法相比较。对单链抗体的筛选方法进行了改进，进一步提高筛选的阳性率，并对所获得的单克隆噬菌体进行可溶性表达、纯化后进行亲和力测定，对其抗原结合性质进行鉴定。使有利于作为肝癌基因治疗的靶向分子，为其作为肝癌的基因靶向能在体内应用奠定基础。[方法]1、去唾液酸糖蛋白受体的原核表达、纯化与鉴定以含去唾液酸糖蛋白受体基因的质粒（pEA1）为模板，设计引物，通过聚合酶链反应（PCR）扩增产物并将扩增的产物去唾液酸糖蛋白受体基因H1定向克隆到原核表达载体pET-32c中。接种含H1／pET-32c的BL21单菌落至LB肉汤中，1:100稀释转种后用1mmol／L终浓度的IPTG诱导表达，其表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化。2、捕获噬菌体法ELISA筛选抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体用纯化重组去唾液酸糖蛋白受体（rASGPR）作为包被抗原，采用捕获噬菌体ELISA对人源噬菌体抗体库进行四轮筛选和鉴定，并对筛选到的抗rASGPR单链抗体进行DNA测序、表达、纯化、和Western Blot鉴定。3、去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的可溶性表达及亲和常数测定将上述筛选到的W1噬菌体克隆感染E．coli HB2151，挑取单个菌落接种于2xTY培养基中，于37℃震荡培养过夜。将培养物作1:100稀释并转种后，用终浓度为0.25、0.5、1.0 mmol／L的IPTG，分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清，用饱和硫酸铵沉淀后，以120 g／L SDS-PAGE分析表达强度。另外，将饱和硫酸铵沉淀物用30 mL PBS重新溶解、透析除盐后，用Ni2+螯合柱进行纯化，再以120 g／L SDS-PAGE鉴定纯化scFv W1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。[结果]1、重组去唾液酸糖蛋白（rASGPR）受体特性分析H1／pET-32c在原核系统中成功表达和纯化出约50.3kDa大小的融合蛋白，用纯化的rASGPR成功制备了羊抗人rASGPR多克隆抗体，并用6His-H1和GST-H1重组蛋白进行Western Blot分析，证实了抗体的正确性。2、抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体制备通过Ni2+亲和柱纯化获得rASGPR融合蛋白后，采用捕获噬菌体ELISA法进行经四轮筛选后，在60个噬菌体克隆中有45株与rASGPR特异性结合，其中仅1株与重组蛋白标签有交叉结合反应。DNA序列分析表明有9株DNA序列各异，9株可分泌性表达与rASGPR特异性结合的单链抗体，纯化的单链抗体也可特异性识别rASGPR，计算该筛选方法的假阳性率为2％，而用间接噬菌体ELISA筛选的假阳性率高达58％。3、抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体亲和常数测定噬菌体W1用0.5 mmol／L IPTG在25℃诱导过夜，表达的scFv W1融合蛋白的量较多，其相对分子质量（Mr）约为28 000，以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2+亲和柱纯化后获得scFv W1蛋白的纯度在95％以上，产量约为0.8 mg／L。scFv的亲和常数为（2.31±0.36）×10-7mol／L。[结论]在原核表达系统中成功表达和纯化得到重组去唾液酸糖蛋白受体，该重组去唾液酸糖蛋白受体具有较强的免疫原性；以该重组去唾液酸糖蛋白受体作为抗原筛选TomlinsonⅠ噬菌体抗体库，采用捕获噬菌体ELISA法筛选rASGPR特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签（Trx·Tag）引起的假阳性，提高筛选阳性率，并可快速筛选出9株具有rCRDH1特异性的scFv；筛选得到的W1噬菌体感染E．coliHB2151后，可诱导表达低亲和力的可溶性scFv，该单链抗体具有中低亲和力，对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、缩略词表
• 四、前言
• 参考文献
• 五、论文正文
• 第一部分:去唾液酸糖蛋白受体的原核表达及多克隆抗体的制备
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:捕获噬菌体ELISA法筛选抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分:去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的可溶性表达及亲和常数测定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 六、攻读学位期间撰写论文
• 七、综述 单链抗体的生物学特性及其在肿瘤诊断治疗中的应用
• 八、致谢