BBP对斑马鱼的毒性效应研究及斑马鱼AChE基因的克隆与表达

论文摘要

邻苯二甲酸丁基苄酯（简称BBP）作为较高级的增塑剂、添加剂和软化剂,广泛用于塑料包装、润滑剂、装饰材料、医药等行业。BBP来源广泛,并且具有难降解等特性,已经成为备受关注的全球性环境污染物之一,有“第二个全球性PCB（多氯联苯类）污染物”之称。研究报道BBP对生物体具有较强的富集作用,并且具有睾丸毒性、胚胎毒性和致畸性,可引发血清中睾酮减少、促卵激素的增加及子宫增大,并改变性别分化；此外,它能引起过敏症及哮喘,对人的神经系统也有影响。因此探讨其对生物体产生的毒理效应的机制具有重要意义。本实验用静态鱼类急性试验方法研究BBP对斑马鱼的毒性效应。结果表明,BBP对斑马鱼96h-LCso为3.98 mg·L-1。在此基础上,设置4个浓度梯度：0、0.332、0.665、1.33 mg·L-1,研究了在不同时间（7、14、21、28d）暴露下,BBP对斑马鱼超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、过氧化氢酶（CAT）活性的影响。实验期间（0-28d）,AChE活性基本呈现下降趋势；SOD活性呈现低浓度刺激、高浓度抑制效应,在14d时,各处理组SOD活性达到最高水平（分别为13.51,14.72,11.81,10.19 U/mg）；CAT活性,除0.665 mg·L-1浓度组在第7d时,呈现出极显著抑制作用（p<0.01）外,其余各处理组CAT活性与对照接近,均无显著差异。本实验从基因转录水平分析了BBP对斑马鱼的毒性,采用半定量RT-PCR技术检测了不同浓度BBP（0、0.332、0.665、1.33 mg·L-1）暴露7d下斑马鱼脑组织和肌肉组织AChE、SOD及CYP1A基因转录量的变化。结果显示,在斑马鱼脑及肌肉组织,AChE基因的相对转录量随着暴露浓度的升高均呈现下降趋势,这与酶活性测定的结果一致；在斑马鱼脑组织中,SOD基因的相对转录量随着浓度的升高首先呈现出下降趋势,但在1.330 mg·L-1浓度组逐步回升。在斑马鱼肌肉组织中,SOD基因的相对转录量随着浓度的升高整体呈现抑制作用,抑制率分别为19.33%,17.86%,17.23%；斑马鱼脑组织CYPIA基因的相对转录量呈现先上升后下降的趋势,在肌肉组织中CYPIA基因相对转录量呈现先下降后上升的趋势。本实验采用基因工程技术成功克隆了斑马鱼脑组织乙酰胆碱酯酶（AChE）基因的cDNA序列,序列全长1905bp,并将其亚克隆到原核表达载体,构建了重组表达质粒,转化到E.coli BL21进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明诱导后在69kDa出现特异的蛋白质条带,与斑马鱼AChE蛋白大小一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 BBP的理化性质
• 1.2 BBP的污染来源
• 1.2.1 聚氯乙烯塑料制品
• 1.2.2 室内装饰材料
• 1.2.3 其他
• 1.3 BBP的代谢
• 1.3.1 BBP在体外的降解
• 1.3.1.1 生物降解
• 1.3.1.2 光催化降解
• 1.3.1.3 声化学降解
• 1.3.2 BBP在体内的代谢
• 1.4 BBP的毒理效应
• 1.4.1 急性毒性
• 1.4.2 神经毒性
• 1.4.3 致癌、致畸、致突变作用
• 1.4.4 生殖毒性
• 1.5 世界各地出台的关于BBP的法规
• 1.5.1 欧盟关于限制邻苯二甲酸类使用的规定
• 1.5.2 美国发布的关于邻苯二甲酸酯类限量的法规
• 1.5.3 REACH法规关于BBP的规定
• 1.5.4 中国关于PVC塑料用品的规定
• 1.6 生物标志物在毒理学研究中的应用
• 1.6.1 选择生物标志物的原则
• 1.6.2 生物标志物的特点
• 1.6.3 现有的分子生物标志物
• 1.7 半定量RT-PCR技术在毒理学研究中的应用
• 1.8 乙酰胆碱酯酶（ACHE）在农药残留检测中的应用
• 1.9 本研究的立题依据及意义
• 第二章 BBP对斑马鱼ACHE、SOD及CAT活性的影响
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方案设计
• 2.3.1 急性毒性试验
• 2.3.2 BBP毒性试验
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线
• 2.4.2 乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的测定
• 2.4.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 2.4.4 过氧化氢酶（CAT）活性的测定
• 2.4.5 统计分析
• 2.5 实验结果与分析
• 2.5.1 考马斯亮蓝测定牛血清蛋白的标准曲线
• 2.5.2 96h急性毒性试验
• 2.5.3 BBP对斑马鱼AChE活性的影响
• 2.5.4 BBP对斑马鱼SOD活性的影响
• 2.5.5 BBP对斑马鱼CAT活性的影响
• 2.6 讨论
• 2.6.1 BBP对斑马鱼96h急性毒性试验的影响
• 2.6.2 BBP对斑马鱼乙酰胆碱酯酶（AChE）的影响
• 2.6.3 BBP对斑马鱼超氧化物歧化酶（SOD）的影响
• 2.6.4 BBP对斑马鱼过氧化氢酶（CAT）的影响
• 第三章 BBP对斑马鱼ACHE、SOD及CYP1A基因转录的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 BBP毒性试验
• 3.3.2 RNA的提取—Trizol法
• 3.3.3 cDNA的合成——两步法RT-PCR
• 3.3.4 统计分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 BBP对斑马鱼脑组织AChE、SOD、CYP1A基因相对转录量的影响
• 3.4.2 BBP对斑马鱼肌肉组织AChE、SOD、CYP1A基因相对转录量的影响
• 3.5 讨论
• 3.5.1 BBP对斑马鱼AChE基因转录水平的影响
• 3.5.2 BBP对斑马鱼SOD基因转录水平的影响
• 3.5.3 BBP对斑马鱼CYP1A基因转录水平的影响
• 第四章 斑马鱼乙酰胆碱酯酶基因的克隆与表达
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 组织、菌株和质粒
• 4.2.2 主要化学试剂及工具酶
• 4.2.3 常用缓冲液
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 斑马鱼脑组织RNA的提取——Trizol法（同第三章3.2.2）
• 4.3.2 斑马鱼脑组织AChE cDNA的合成——两步法RT-PCR
• 4.3.3 DNA片段的回收
• 4.3.4 DNA限制性内切酶消化
• 4.3.5 DNA片段的连接
• 4.3.6 Ecoli感受态细胞的制备和转化
• 4.3.7 质粒DNA的提取
• 4.3.8 阳性克隆的筛选与重组质粒的鉴定
• 4.3.9 蛋白质的原核表达
• 4.3.10 表达产物的SDS-PAGE分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 斑马鱼脑组织RNA的提取
• 4.4.2 RT-PCR扩增斑马鱼脑组织AChE基因
• 4.4.3 斑马鱼脑组织AChE基因重组克隆载体pMD-ace的构建及鉴定
• 4.4.4 斑马鱼脑组织AChE基因cDNA的测序结果与分析
• 4.4.5 斑马鱼脑组织AChE基因重组表达载体pMAL-ace的构建及鉴定
• 4.4.6 斑马鱼重组表达载体pMAL-ace在E.coli中的表达
• 4.5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 衷心感谢以下基金资助
• 致谢