论文题目: SK&F96365对正常及缺血再灌注小鼠肝细胞的Ca～（2+）通道的影响
论文类型: 硕士论文
论文专业: 外科学
作者: 张驰
导师: 张宗明
关键词: 肝细胞,缺血再灌注,钙池操纵的通道,膜片钳
文献来源: 同济大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的：建立适用于膜片钳记录技术的ICR小鼠肝细胞的急性分离方法，利用膜片钳技术证实ICR小鼠肝细胞表面具有钙池操纵的Ca2+通道(store-operated Ca2+channels，SOC)，进而研究正常小鼠肝细胞SOC电流(currents of soc，ISOC)的特性。建立适用于膜片钳研究的小鼠肝脏缺血再灌注模型，分离缺血再灌注后的肝细胞，测定并研究缺血再灌注小鼠肝细胞的ISOC。最后观察钙离子通道抑制剂SK&F96365对正常和缺血再灌注ICR小鼠肝细胞ISOC的影响。方法：以ICR小鼠为实验动物，采用Ⅳ型胶原酶进行原位两步灌流法来获取肝细胞。采用全细胞膜片钳记录技术研究SOC，标准电极内液含有10mmol／L的EGTA和2μmol／L的thapsigargin以鳌合Ca2+、阻碍钙池的再补充从而激活SOC，观察在各种钳制电位下ISOC的情况。采用断流肝脏中叶和左叶的门静脉和肝动脉后15分钟后再恢复血流15分钟的方法，建立适用于膜片钳研究的小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，并分离肝细胞用以膜片钳实验。应用快速加药灌流装置将5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、50μmol／L的SK&F96365加至正常和缺血再灌注小鼠肝细胞周围，记录ISOC，观察SK&F96365的影响作用。结果：Ⅳ型胶原酶原位两步灌流法操作相对简便，用酶量少，获得的小鼠肝细胞形态结构完整，呈圆形，透亮，具立体感，纯度较高可达93％，极少见到间质细胞。肝细胞存活率平均可达88.4％，活肝细胞总数（产量）平均可达3.2×107／肝脏，经孵育后易贴壁，在后续膜片钳实验中较易形成巨阻封接、易于破膜，细胞膜弹性和形态可维持6小时左右。向胞内透析EGTA和thapsigargin可以降低钙池内Ca2+浓度，从而激活细胞膜上的SOC导致Ca2+内流，记录到明显的ISOC，该电流稳定并在5分钟内无衰减。保持电位0mV，膜电位钳制于-100mV时，正常小鼠肝细胞ISOC的峰值电流为-245.95±81.45pA（n=15）。保持电位0mv，施予-120mV至+60mV，持续时间200ms，阶跃为20mV的串脉冲刺激，频率为0.2Hz，正常肝细胞ISOC的I-V曲线近似线性，逆转电位约为0mV。采用断流肝脏中叶和左叶的门静脉和肝动脉后再开放的方法，建立适用于膜片钳研究的小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，小鼠存活率高，获得的小鼠肝细胞大部分形态结构完整呈圆形，透亮，具立体感，胞质中颗粒较少。部分细胞形状不规则，细胞质中弥漫大小不均匀的颗粒，高倍镜下细胞膜不平滑有颗粒感甚至泡状凸起。肝细胞纯度平均为87.3％，肝细胞活率平均可达79.7％，经孵育后多数易贴壁，在后续膜片钳实验中较易形成巨阻封接、易于破膜，细胞膜弹性和形态可维持3～4小时左右。保持电位0mV，膜电位钳制于-100mV时，缺血再灌注肝细胞的ISOC的峰值电流为-443.64±53.44pA（n=15），对照组ISOC的峰值电流为-219.77±37.86pA（n=15），两者有统计学差异（n=15，p＜0.01）。观察肝脏缺血再灌注损伤对ISOC的影响，可见缺血再灌注模型中ISOC峰值增大，但ISOCI-V曲线线性关系和逆转电位并不改变。在正常小鼠肝细胞上，膜电位钳制于-100mV时，5μmol／L的SK&F96365可使ISOC的峰值电流由对照组的-235.19±48.19pA减小至-215.15±58.40pA，抑制率为9.36±13.7％；随着SK&F96365的浓度的递升，ISOC的峰值电流亦随之减小，50μmol／L的SK&F96365可使ISOC的峰值电流减小至-39.95±7.21pA，抑制率为82.88±1.51％。除5μmol／L的SK&F96365组外，其余各浓度组与对照组相比均有显著统计学差异（P＜0.001，n=6）。随着SK&F96365的浓度递增，阶越指令电位模式下测得的ISOC也出现不同程度的减小，但对它的线性关系几乎并不改变，各组的逆转电位皆约为0mV（n=6）。5-50μmol／L的SK&F96365浓度依赖性地抑制正常ICR小鼠肝细胞ISOC，这种情况下的EC50为21.92μmol／L。在缺血再灌注小鼠肝细胞上，膜电位钳制于-100mV时，5μmol／L的SK&F96365可使ISOC的峰值电流由对照组的-497.96±38.83pA减小至-429.03±47.80pA，抑制率为13.43±11.54％；随着SK&F96365的浓度的递升，ISOC的峰值电流亦随之减小，50μmol／L的SK&F96365可使ISOC的峰值电流减小至-82.24±20.47pA，抑制率为83.48±3.95％。除5μmol／L的SK&F96365组外，其余各浓度组与对照组相比均有显著统计学差异（P＜0.001，n=9）。不同浓度的SK&F96365能不同程度的降低缺血再灌注小鼠肝细胞ISOC的I-V曲线幅度，但对它的线性关系几乎并不改变，各组的逆转电位皆约为0mV（n=9）。SK&F96365 5，10，20，40，50M浓度依赖性地抑制缺血再灌注小鼠肝细胞的ISOC，这种情况下的EC50为16.99μmol／L。结论：本实验成功建立了适用于膜片钳记录技术的肝细胞分离方法，证实了ICR小鼠肝细胞上存在SOC。成功建立了适用于膜片钳研究的小鼠肝脏缺血再灌注模型并分离了肝细胞用于膜片钳研究。缺血再灌注损伤后的ICR小鼠肝细胞ISOC峰值增大，SK&F96365可抑制正常和缺血再灌注小鼠肝细胞的ISOC的峰值，这说明SOC参与了缺血再灌注损伤，通过SOC的扩大化的容积性钙内流可能是肝脏缺血再灌注损伤中钙超载的重要路径，SK&F96365对扩大化的钙内流有抑制作用从而保护缺血再灌注损伤的肝细胞，这为寻找新的拮抗肝细胞Ca2+超载的药物、解决外科临床的实际困难提供了实验依据。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第1章 引言
第2章 适用于膜片钳记录技术的ICR小鼠肝细胞的急性分离方法
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 细胞分离及孵育用液的配制
2.1.3 方法
2.2 结果
2.3 讨论
第3章 正常ICR小鼠肝细胞的I_(SOC)的特性
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 电生理实验用液的配制
3.1.3 ICR小鼠肝细胞I_(SOC)全细胞膜片钳记录技术的实验过程
3.1.4 统计学处理
3.2 结果
3.3 讨论
第4章 适用于膜片钳记录技术的小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的建立及肝细胞分离方法
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 细胞分离孵育用液的配制
4.1.3 方法
4.2 结果
4.3 讨论
4.3.1 HIRI实验模型的构建
4.3.2 HIRI的机制回顾
第5章 肝脏缺血再灌注模型中的ICR小鼠肝细胞的Isoc
5.1 材料与方法
5.1.1 实验材料
5.1.2 细胞分离及孵育用液的配制
5.1.3 电生理实验用液的配制
5.1.4 方法
5.1.5 实验组及对照组小鼠肝细胞I_(soc)全细胞膜片钳记录技术的实验过程
5.1.6 统计学处理
5.2 结果
5.3 讨论
5.3.1 HIRI与钙超载
5.3.2 肝脏缺血再灌注模型中的ICR小鼠肝细胞的I_(SOC)
第6章 SK&F96365对正常及缺血再灌注小鼠肝细胞的I_(SOC)的影响
6.1 材料与方法
6.1.1 实验材料
6.1.2 细胞分离及孵育用液的配制
6.1.3 电生理实验用液的配制
6.1.4 SK&F96365药液的制备
6.1.5 实验分组
6.1.6 正常及缺血再灌注ICR小鼠肝细胞Isoc全细胞膜片钳的实验过程
6.1.7 统计学处理
6.2 结果
6.2.1 SK&F96365对正常ICR小鼠肝细胞Isoc的影响
6.2.2 SK&F96365对缺血再灌注ICR小鼠肝细胞Isoc的影响
6.3 讨论
第7章 结论与展望
7.1 结论
7.2 进一步工作的方向
致谢
参考文献
附录1:钙池操纵的Ca~(2+)通道研究中工具药的应用及进展
附录2:肝细胞钙池操纵的Ca~(2+)通道的研究进展
个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果
发布时间: 2007-12-28
参考文献
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