新型宿主因子在HIV感染和复制中作用及机制研究

论文摘要

背景：人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）是引起获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）的病原体。AIDS是当今世界人类的第四大死亡原因,1981-2009年全球累计有6500万人感染1型人类免疫缺陷病毒,累计导致2500万人死亡；截至2009年10月31日统计,我国约有70万艾滋病感染者；累计报告艾滋病例319877例,其中病人102323例；报告死亡49845例。2010年全国艾滋病病毒感染人数将进一步升高。（1,2）鉴于性传播逐渐成为我国艾滋病传播的主要途径,在现有的卫生医疗条件和人口分布格局下,今后十年内,我国的艾滋病患者数预期将出现快速增长。自1983年发现艾滋病毒到今天,人类对HIV和获得性免疫缺陷综合症AIDS的研究已经进行了长达30多年,在HIV生物学和AIDS发病机理方面取得了重要进展,并对人体抵抗HIV免疫机制有了一定的了解,然而,由于HIV病毒本身的特性,到目前为止仍未找到特效的治疗手段。为了对付病毒的耐药问题,何大一等首创将两种逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂联合用于治疗患者,形成了高效抗逆转录病毒治疗法（即HAART,俗称“鸡尾酒疗法”）。这一疗法可显著降低耐药发生率,使患者获得显著的临床改善并延长其生存期,因此迄今仍然是艾滋病治疗的标准方法。（3）但在较长期的HAART治疗后,特别是患者依从性较差时,耐药病毒株的出现和机会性感染,可以导致治疗的失败。据估计,已有大约50%的艾滋病人对目前临床使用的抗艾滋病药物产生了耐药性。耐药毒株不可避免和持续不断的出现,使得人类对抗HIV成了一场永无止境的战争。（4,5）因此,越来越多的研究者开始尝试一种新的抗病毒策略,即通过抑制参与HIV生活周期的宿主因子（通常是蛋白和酶）来阻断HIV的复制和传播。因为针对宿主因子的化合物可以不直接和艾滋病毒本身的任何结构发生作用,因而在理论上应该不会或极难使病毒产生耐药性。（6-8）很多研究小组通过这种方法已经获得了较好的实验成果,针对宿主因子APOBEC3（9,10）,TRIM5（11）的几种药物已经进入临床实验阶段。因此从宿主因子方面着手来研究抗HIV的方法已经越来越受到各个研究小组的关注。（6,12,13）抗HIV感染的一个很重要的策略,就是对病毒感染和复制起关键作用的蛋白作为药物靶标。HIV很难对以宿主蛋白为靶标的抗病毒药物产生抗药性。因为要做到这一点,病毒必须要进化出一种全新的能力,而非仅仅对一个药物结合位点产生突变。从HIV的生活周期入手,自发现CD4是HIV的受体开始,经过30多年的研究,人们发现了多个与病毒复制相关的宿主蛋白。（14-16）尤其是最近使用的全基因组siRNA筛选技术,使人们获得了更多的HIV复制相关蛋白,约250种,其中包括237种人类前所未知的宿主相关蛋白。（13,17,18）然而,虽然人类在发现与HIV复制相关的宿主蛋白上有重大的突破。但是,却有更多的问题有待人们去探讨和解决。比如,近百种以前未知的宿主相关蛋白的作用机制是什么?哪一些是HIV复制的限制蛋白?哪一些是HIV复制的促进蛋白?以限制蛋白作为抗HIV药物靶标的有效性如何?这些以宿主蛋白为靶标的药物在对感染细胞产生杀伤作用的同时,会不会对正常细胞也造成不可弥补的损失?等等。今后宿主因子与HIV之间的研究方向,更加注重于宿主蛋白的功能对于HIV的感染和复制影响和相关机制的研究,找出有意义的抗HIV干预靶标,从而对于开展抗HIV药物研发或者抗HIV的治疗提供实验基础。本研究这个课题是从SiRNA筛选技术中确定的两种蛋白（FBXL20和RON）,从不同的方面来观察它们在HIV感染复制方面的作用及机制。目的：本课题旨在运用HIV感染细胞共培养体系,研究新型宿主因子蛋白FBXL20 （F-box and leucine-rich repeat protein 20）和RON （recepteur d’origine nantais）在HIV感染过程中的作用及其影响机制,来进一步探讨以新型宿主因子为靶标抗HIV感染和复制的潜在意义,为艾滋病的发病机制研究提供了坚实的实验基础。材料与方法：运用RT-PCR （逆转录-聚合酶链反应）和Western blot（免疫共沉淀）的方法检测T细胞上FBXL20和RON蛋白的表达；并采用细胞共培养的方法,建立HIV感染T细胞的细胞体系,在HIV感染的基础上进行检测T细胞中FBXL20和RON蛋白的表达改变情况,再运用SiRNA的方法干扰T细胞中FBXL20蛋白的表达,检测HIV感染T细胞的状态,从而判定FBXL20蛋白在HIV感染过程中的作用；体外构建表达RON蛋白和HIV-1 Tat蛋白的细胞系,以此为基础研究HIV和HIV-1Tat蛋白对于RON蛋白的表达和功能影响。同时检测相关的信号转导通路关键分子,揭示宿主因子RON与HIV感染之间相互作用的机制。结果：1、成功构建了体外HIV感染T细胞体系,并对此系统进行了评价。这个体系适用于宿主因子与HIV感染关系研究的需要,同时也为本研究提供了坚实的实验基础。2、RT-PCR和Western blot结果显示,FBXL20和RON两种蛋白在T细胞系中特异性高表达,细胞免疫结果显示FBXL20蛋白定位于细胞质中,而RON蛋白是胞膜蛋白。3、运用RNA干扰试验,成功的干扰FBXL20蛋白在T细胞中的表达,干扰率达70-80%。运用共培养系统,对于HIV感染T细胞（进行RNA干扰和未进行RNA干扰）的感染效率以及感染水平,通过流式细胞仪进行检测,进行RNA干扰后的细胞荧光值与对照组相比升高约7倍左右,并且随时间的推移感染效果逐渐减退。4、HIV感染后,JLTRG细胞中RON的表达和磷酸化水平下降,同时本研究的研究表明HIV降低酪氨酸激酶的作用,主要是HIV Tat蛋白的作用。通过对于以上组别之间的NF-kB信号通路关键分子进行检测,发现Tat蛋白刺激后细胞组,NF-kB信号通路关键分子的表达和磷酸化水平降低约20%。结论：1、建立的HIV感染T细胞体系,适用于宿主因子与HIV感染关系研究的需要,同时也为本研究提供了坚实的实验基础。2、首次确定泛素系统因子FBXL20蛋白可抑制HIV的感染和复制；与之类似,RON蛋白对于HIV的感染和复制也有抑制作用,即FBXL20和RON蛋白均为HIV感染和复制的负调节宿主因子。RON的这种抑制作用与NF-kB信号通路有关3、HIV可以降低宿主因子RON的表达,同时抑制RON的磷酸化水平,证明机体感染HIV后,宿主因子RON蛋白的功能受到抑制。在这个过程中HIV-1 Tat蛋白起到了很大的作用,Tat蛋白通过跨膜作用于细胞核NF-kB信号通路从而使RON的表达下降,同时下调RON的磷酸化水平,又可以通过调节NF-κB途径增强HIV病毒的复制和转录。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩写清单
• 目次
• 第一部分 HIV感染细胞体系的建立
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 实验结果
• 4 实验结论
• 第二部分 泛素体系因子FBXL20在艾滋病感染过程中的作用
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 实验结果
• 4 实验结论
• 第三部分 HIV及其TAT蛋白可以影响RON蛋白的表达和其磷酸化水平
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 实验结果
• 4 实验结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简介
• 读研期间科研成果
• 发表的文章
• 专利
• 研究生期间获奖情况
• 参加的课题