组织工程人工骨成骨活性因子（BMP9，OPG）相关研究

论文摘要

骨形态发生蛋白（BMP）是作为成骨因子最初在骨基质中发现的,BMPs是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员之一,目前已经分离和鉴定的有20余种。BMP主要的生物学作用是诱导成骨潜能细胞,如结缔组织中的间质细胞、骨髓基质细胞、滑膜细胞和成纤维细胞等在骨骼或骨骼外转化形成软骨和骨组织。除了促进成骨分化的作用以外,BMPs在很多组织和器官的发育中也发挥着重要的作用,比如:心,肺,肾,眼睛,生殖组织,神经系统,胎盘和胎盘连接,血管和血管生成,脂肪组织的形成。目前发现的具有诱导成骨分化能力的BMP主要有BMP2、4、6、7、9,其中rhBMP2和rhBMP7纯蛋白已经在国外临床上用于骨折延迟愈合、骨折不愈合、骨折骨不连、骨缺损、脊柱融合术的治疗,而且取得了一定的治疗效果。C2C12、C3H10细胞以及裸鼠皮下注射的体外和体内实验对AdBMP2、4、6、7、9进行研究,结果提示BMP9诱导成骨能力远远强于传统应用的BMP2和BMP7。以往的研究已经在细胞和小动物水平证实了BMP9的成骨能力,但是BMP9在更接近于人类的大动物体内研究尚未有报道。进一步对BMP9和BMP2、BMP4、BMP6、BMP7之间的协同作用进行研究,结果发现BMP之间存在协同作用,其中BMP9和BMP2的协同作用最强。单独BMP9以及BMP9和其它BMP的协同运用为组织工程人工骨成骨活性因子提供了一个新的选择。但是由于BMP9相关的大动物水平的研究相当缺乏,在大动物水平,特别是负重骨骨缺损模型上研究BMP9自身的成骨能力、BMP之间的协同作用已经十分必要。为了更好地研究BMP之间的协同作用,如何避免因为基因表达相互干扰和腺病毒滴度测定中的误差对实验结果的准确性造成影响,使各种BMP的表达达到1:1的水平也是急需解决的问题。骨保护素（OPG）也称为破骨细胞生成抑制因子,是一种分泌型糖蛋白,由401个氨基酸组成。OPG主要通过调节RANKL/RANK/OPG系统,促进新骨的生成,抑制骨的吸收,从而达到促进成骨的作用。RANKL是骨保护素的同源配基,主要表达于成骨细胞和骨髓基质细胞的表面,RANK主要表达于破骨细胞或其前体表面。RANKL与RANK结合后可以促进破骨细胞的活化、成熟,从而促进骨吸收。OPG是RANKL的诱饵受体,与RANK竞争性结合RANKL,OPG与RANKL的结合减少了RANKL与RANK的结合,从而抑制破骨细胞分化、成熟,减少骨吸收。另外OPG能够通过诱导碱性磷酸酶和钙化结节形成促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。骨活素胶囊系在护骨胶囊的基础上改良而得,是纯中药提取的,其主要成分淫羊藿苷可通过促进成骨细胞分泌骨保护素,调节RANKL/RANK/OPG的动态平衡机制,从而有效地减少骨吸收,间接地促进了骨生成。由于骨活素胶囊是纯中药提取,毒副作用小,可以有效地治疗骨质疏松症,而且骨活素胶囊促进了OPG的分泌,OPG又可以通过调节骨代谢和骨诱导促进骨再生,所以骨活素胶囊为骨折、骨缺损伴有骨质疏松症的病人提供了一个很好的选择。但是目前尚未有这方面的研究报道。在对骨质疏松性骨折进行治疗时离不开手术对骨折部位的复位和固定,利用合理的手术方式既能对骨折进行良好的复位和固定,又能最大程度上对骨折部位及周围进行保护,将有利于骨质疏松性骨折的愈合。本研究的目的:1、观察BMP9介导的人工骨在大动物负重骨骨缺损模型（山羊股骨中段临界骨缺损模型）中的促进成骨能力。2、构建双表达BMP2、9腺病毒载体,使BMP2和BMP9达到精确的1:1表达,进一步验证和研究BMP2和BMP9的协同效应。3、观察骨活素胶囊在骨质疏松性骨折模型（兔桡骨骨质疏松性骨折模型）中的成骨情况,探讨OPG用于人工骨组成部分的可能性。4、介绍一种新型的微创手术方式治疗骨质疏松性骨折,为人工骨治疗骨折疏松提供良好的复位和固定。文章第一部分:方法:12只12-18月龄中国青山羊,股骨中段建立临界骨缺损模型,随机分为两组,缺损区域明胶海绵填充,实验组加入预先准备好的BMP9腺病毒感染的骨髓基质细胞悬液,对照组加入GFP腺病毒感染的骨髓基质细胞悬液,术后1天、2周、4周、8周、12周、20周行X片检查,20周时进行CT检查,处死动物,行大体标本、组织学染色和生物力学的检测。结果:X片显示实验组较对照组骨痂形成更早更多,大体标本、组织学染色显示实验组的新生骨更加成熟,CT显示实验组新生骨塑形更好,生物力学检测显示实验组新生骨痂的力学强度更强。结论:BMP9介导的组织工程人工骨可以有效地促进山羊股骨骨缺损的愈合。同时实验结果也发现BMP9在体内能够促进脂肪的分化。治疗五个月后BMP9人工骨治疗组与正常骨在形态和生物力学特性上仍有差距,如何避免脂肪分化,寻找更强的成骨活性因子组合有待进一步研究。文章第二部分:方法:自单一表达BMP2或BMP9 AdEasy质粒上扩增BMP2和BMP9片段,先后亚克隆至穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质粒pASG2-BMP2、9,酶切及PCR鉴定确认、测序正确后同源重组获得双表达BMP2、BMP9腺病毒质粒,转染至HEK-293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP2、BMP9腺病毒,体外感染C3H10细胞RT-PCR鉴定其表达并观察其早期诱导成骨情况。结果:成功构建双表达BMP2、BMP9的腺病毒,滴度约为1010IU/ml,RT-PCR证实此腺病毒在C3H10细胞中表达,观察到绿色荧光,其感染C3H10细胞的早期碱性磷酸酶含量较感染单一表达BMP2或BMP9腺病毒的C3H10细胞增加。结论:成功构建双表达BMP2、9的重组腺病毒载体,初步验证了BMP2、9能够早期协同成骨,为进一步研究BMP2和BMP9的协同成骨作用和制备高效的组织工程人工骨提供了有利的工具。文章第三部分:方法:40只8-12月龄雌性新西兰大耳兔,卵巢去势法10周得到Ⅰ型骨质疏松模型,再行桡骨骨折造模,从而建立骨质疏松性骨折模型。模型建立后随机分为2组,实验组和对照组分别给予含1g/Kg·d骨活素胶囊的生理盐水和淀粉糊5ml灌胃,在2、4、8周随机选取动物行影像学、血液生化指标、HE染色、pcna免疫组化和生物力学检测。结果:骨活素干预的实验组动物较对照组骨痂、骨小梁形成增多增快,骨痂力学强度增强。结论:骨活素胶囊能使骨质疏松性骨折的愈合时间缩短,强度增强。文章第四部分:介绍一种微创外科手术方式（椎体后凸成形术）,为骨质疏松性骨折人工骨替代治疗提供新的选择。方法: 2006年3月- 2007年8月,收治60例骨质疏松性脊柱骨折患者。其中40例选择椎体后凸成形术治疗（试验组）,20例选择保守治疗（对照组）。试验组:男6例,女34例;年龄56～78岁,平均68.7岁。病程10～18个月,平均12个月。骨折涉及73个椎体。对照组:男5例,女15例;年龄57～80岁,平均70.1岁。病程9～16个月,平均13个月。骨折涉及41个椎体。两组患者性别、年龄、病程、疼痛视觉模拟评分（VAS）、欧洲脊柱骨质疏松症研究（EVOS）问卷评分,以及伤椎前中柱椎体高度、后凸Cobb角比较,差异均无统计学意义（P > 0.05）,具有可比性。结果:试验组患者术后切口均Ⅰ期愈合,无骨水泥渗漏。两组患者均获随访,随访时间36～38个月。试验组治疗后1～3 d及12、36个月VAS评分、EVOS评分、伤椎前中柱椎体高度及后凸Cobb角均较术前明显改善（P < 0.05）;对照组治疗后以上指标与术前比较无改善（P > 0.05）。治疗后12、36个月,试验组以上指标均优于对照组（P < 0.05）。治疗后36个月,对照组患者新发脊柱骨折发生率高于试验组（χ2=16.347,P=0.015）。结论:椎体后凸成形术治疗骨质疏松性脊柱骨折后,疼痛症状可明显缓解,活动功能恢复,且新发脊柱骨折发生率较保守治疗低。综上所述,BMP9的诱导成骨能力在大动物骨缺损模型中得到证实,BMP2和BMP9具有协同效应,OPG能够促进OPF的愈合,PKP微创治疗也能促进OPF的愈合。BMP9、AdBMP2,9、OPG为人工骨成骨因子提供了新的选择,微创手术与人工骨移植的结合,将更好地治疗骨缺损、骨折不愈合、OPF等疾病。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 BMP9 介导的人工骨治疗骨缺损的实验研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 双表达BMP2、9 重组腺病毒载体的构建和表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 骨活素胶囊对骨质疏松性骨折愈合影响的实验研究
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四部分 椎体后凸成形术治疗骨质疏松性脊柱骨折的临床研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表文章