DHEA对TM-3细胞生物学特性的影响及其生物转化规律研究

论文摘要

类固醇激素对于动物的生长发育有十分重要的作用。胆固醇在相关组织器官特殊酶系的作用下转化为雄激素、雌激素、孕激素等类固醇激素的过程中,脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone, DHEA）作为最重要的代谢中间产物有独特的作用,因而被称为具有多向性的“激素缓冲剂”。不仅如此,研究还证实,DHEA具有抗衰老、调控脂代谢、提高机体免疫力、增强细胞活性、促进动物健康等多种作用,且其生物学功能的呈现须归结于其代谢转化的中间产物和终产物。睾丸间质细胞是机体合成和分泌睾酮的主要细胞。有试验表明,外源性DHEA可显著提高机体血清雄激素水平,但DHEA对睾丸间质细胞生物学特性的影响及其生物转化过程,目前还鲜有报道。因此,本文以TM-3细胞（小鼠睾丸间质细胞）为研究对象,探讨DHEA对TM-3细胞周期变化和线粒体超微结构及功能的影响；采用以液-质联用（LC-MS）技术分析DHEA在TM-3细胞中的生物转化及其转化过程的主要中间产物和终产物的动态变化和消长规律,并对DHEA生物转化关键酶表达进行分析,旨在勾画出DHEA在睾丸间质细胞中生物转化的细节和归宿,以丰富和充实对于类固醇代谢的认识,为促进动物健康养殖和人类相关疾病的防控提供理论依据。1DHEA对TM-3细胞周期的影响本试验以TM-3小鼠睾丸间质细胞系为研究对象,探讨DHEA对睾丸间质细胞周期和周期因子mRNA表达的影响。用含DHEA终浓度分别为0μmol/L、1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的培养液孵育TM-3细胞。分别作用6h、12h、24h和48h后,收集细胞,待测。倒置相差显微镜观察DHEA对TM-3细胞生长的影响；流式细胞法检测DHEA对TM-3细胞周期的影响；Realtime-PCR检测DHEA对TM-3细胞周期相关因子CDK2、cyclinA和cyclinB mRNA表达的影响；试剂盒法测定DHEA对TM-3细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性的变化。结果表明,50μmol/L和100μmol/L DHEA处理24h后,可显著抑制TM-3细胞的生长；与对照组相比,50μmol/L和100μmol/L DHEA处理12h后,可升高TM-3细胞S期和G2/M期细胞比例升高,降低G0/G1期细胞比例,但仅在48h时达到统计差异（P<0.01）；与对照组相比,100μmol/L DHEA处理可显著下调TM-3细胞中cyclinA和cyclinB mRNA的表达水平（P<0.05）,不同剂量的DHEA处理对TM-3细胞中CDK2无统计学上的差异,但均有降低CDK2表达的趋势（P>0.05）；同时,50μmol/L和100μmol/L DHEA处理可显著抑制G6PD的活性（P<0.05）。结果提示,DHEA处理可抑制TM-3生长,其主要机制是DHEA可显著抑制TM-3细胞中G6PD的活性,并通过下调cyclinA、cyclinB和CDK2基因的mRNA表达水平,致使TM-3细胞滞留于S期和G2/M期,从而抑制细胞的生长。2DHEA对TM-3细胞线粒体超微结构和功能的影响本试验以TM-3小鼠睾丸间质细胞系为研究对象,探讨DHEA对TM-3细胞线粒体超微结构和功能的影响。用含DHEA终浓度分别为0μmol/L、1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的细胞培养液孵育细胞,在作用48h后收集细胞,透射电镜观察DHEA对TM-3细胞线粒体形态及数量的影响；流式细胞法检测DHEA对TM-3细胞线粒体膜电位的影响；试剂盒法测定SDH活性变化。结果显示,1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L DHEA处理对TM-3细胞线粒体形态和数目无显著差异（P>0.05）；1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L DHEA处理均可降低TM-3细胞线粒体膜电位下降,与对照组相比与对照组相比,100μmol/L DHEA处理可显著降低TM-3细胞线粒体的膜电位（P<0.05）；1μmol/L和50μmol/L DHEA处理对TM-3胞内琥珀酸脱氢酶（SDH）活性并无显著影响（P>0.05）,但100μmol/L DHEA处理则可显著提高胞内SDH的活性（P<0.05）。结果提示,外源性.DHEA处理对TM-3细胞线粒体的形态和数量无显著影响；但100μmol/L DHEA处理可通过降低细胞线粒体膜电位而增加线粒体的通透性,同时通过增加SDH的活性而提高细胞的氧化代谢水平,以平衡细胞自身对能量的需求。3DHEA在TM-3细胞中的生物转化及其对类固醇激素代谢关键酶表达的影响本试验以TM-3细胞为研究对象,探讨DHEA在胞内的生物转化及其对类固醇激素代谢关键酶表达的影响。以含DHEA终浓度为100μmol/L的培养液处理细胞,以只含有相同浓度DMSO（0.1%）为对照组,分别在DHEA孵育0h、3h、12h、24h和48h后收集细胞及培养液。采用液质联用技术检测细胞裂解液中DHEA、睾酮、雌二醇、雌酮、孕酮、皮质醇、皮质酮、17α-羟孕酮含量变化；Real-time PCR和western blot法检测类固醇代谢途径中关键酶／蛋白因子的表达变化。结果表明,TM-3细胞经100μmol/L DHEA处理0h、3h、12h、24h和48h后,细胞裂解液中DHEA的浓度从34.12ng/mL （Oh）下降到17.90ng/mL（48h）；睾酮含量随着DHEA处理时间的延长逐渐增加,其含量在3h-48h内从0.256ng/mL增加到5.41ng/mL,睾酮和DHEA之间表现显著的负相关（P<0.05）；雌二醇随着处理时间的延长逐渐增加,其含量从15.26ng/mL （Oh）增加到167.16ng/mL（48h）,雌二醇与DHEA之间呈现显著的负相关（P<0.05）；雌酮和皮质醇的浓度随着处理时间的延长而逐渐降低,两者与DHEA间均呈现显著的正相关,其相关系数分别为0.958（P<0.01）和0.752（P<0.01）；孕酮虽然在DHEA处理0-3h内未检测到,但在处理12-48h后的细胞裂解液中孕酮含量则显著升高；皮质酮和17α-羟孕酮含量均因低于检测限未能检出；与对照组相比,DHEA处理12h后细胞总胆固醇水平显著下降（P<0.05）。相关酶／蛋白因子分析表明,DHEA处理3h后StAR mRNA表达显著降低（P<0.05）,而后其表达升高,在24h和48h时显著高于对照组（P<0.01）；P450scc mRNA表达在DHEA处理3h显著提高（P<0.05）,随后表达下降并在12h后恢复到正常水平；DHEA处理3h可显著提高CYP17α mRNA表达水平（P<0.05）,而后其表达水平逐渐降低并再次升高,至DHEA处理24h和48h时CYP17α mRNA表达水平又显著高于对照组（P<0.05）；DHEA处理12-48h内,TM--3细胞内3β-HSD蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,与其对照组相比,DHEA处理TM-3细胞24-48h可显著提高3β-HSD蛋白表达水平（P<0.05）；17β-HSD蛋白水平在在DHEA处48h时显著升高（P<0.05）,处理组内不同时点17β-HSD蛋白表达水平无显著性变化（P>0.05）；芳香化酶蛋白水平随着DHEA处理时间的延长逐渐降低,在DHEA处理24-48h内,TM-3细胞中芳香化酶的蛋白表达水平则显著降低（P<0.05）。结果提示,DHEA与其在TM-3细胞中的生物转化中中间产物与终产物及终产物之间存在着显著的消长关系,伴随着睾酮和雌二醇含量的增多,其代谢途径中的大部分中间物的含量逐渐降低,类固醇代谢途径中关键酶／蛋白因子的表达也表现出一定的时序性变化,且这种变化与DHEA在TM-3细胞中的代谢转化进程基本相一致。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 脱氢表雄酮生物学功能研究进展
• 1 DHEA的合成、代谢与分布
• 2 DHEA的生物学功能
• 2.1 DHEA与机体物质代谢
• 2.2 DHEA与抗氧化作用
• 2.3 DHEA对中枢神经系统的影响
• 2.4 DHEA对免疫系统的影响
• 2.5 DHEA对心血管系统的影响
• 2.6 DHEA对骨质代谢的影响
• 3 DHEA调节机体生理功能的的作用机制
• 3.1 DHEA的激素样效应
• 3.2 DHEA的非激素样效应
• 参考文献
• 第二章 类固醇激素的生物合成与代谢
• 1 类固醇激素的生物合成
• 2 类固醇激素合成的关键酶/蛋白因子
• 2.1 类固醇合成急性调节蛋白
• 2.2 细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶
• 2.3 17α-羟化酶
• 2.4 3β-羟基类固醇脱氢酶
• 2.5 17β-羟基类固醇脱氢酶
• 2.6 芳香化酶
• 3 类固醇激素的分解代谢
• 3.1 皮质激素的分解代谢
• 3.2 雄激素的分解代谢
• 3.3 雌激素的分解代谢
• 4 DHEA与类固醇激素代谢
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第三章 DHEA对TM-3细胞周期影响的研究
• 摘要
• 1. 材料和方法
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.2 细胞培养及鉴定
• 1.3 DHEA对TM-3细胞增殖的形态学观察
• 1.4 DHEA对TM-3细胞周期的影响
• 1.5 DHEA对TM-3细胞G6PD活性的影响
• 1.6 Real-time PCR法测定周期蛋白mRNA表达水平
• 1.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 TM-3细胞形态学观察及免疫学鉴定
• 2.2 DHEA对TM-3细胞增殖的形态学观察
• 2.3 DHEA对TM-3细胞周期的影响
• 2.4 DHEA对TM-3细胞G6PD活性的影响
• 2.5 DHEA对TM-3细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响
• 3 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.2 小结
• Abstract
• 参考文献
• 第四章 DHEA对TM-3细胞线粒体超微结构和功能影响的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.2 电镜样品制备
• 1.3 细胞膜线粒体电位（△Ψm）测定
• 1.4 琥珀酸脱氢酶（SDH）活性测定
• 1.5 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DHEA对TM-3细胞线粒体超微结构的影响
• 2.2 DHEA对TM-3细胞线粒体膜电位（△Ψm）的影响
• 2.3 DHEA对TM-3细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的影响
• 2.4 DHEA处理后TM-3细胞SDH与G6PD活性变化的相关性分析
• 3 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.2 小结
• Abstract
• 参考文献
• 第五章 DHEA在TM-3细胞中的生物转化及其对类固醇激素代谢关键酶表达的影响
• 摘要
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要试剂和仪器
• 1.2 DHEA对TM-3细胞胞内睾酮含量的影响
• 1.3 DHEA在TM-3细胞中的生物转化
• 1.4 DHEA对TM-3细胞总胆固醇含量的影响
• 1.5 Real-time PCR法测定关键酶mRNA表达水平
• 1.6 Western blot法检测关键酶蛋白的表达
• 1.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DHEA对TM-3细胞胞内睾酮含量的影响
• 2.2 类固醇激素检测方法的建立
• 2.3 DHEA在TM-3细胞中的生物转化
• 2.4 DHEA与其生物转化中间产物及终产物间的相关性分析
• 2.5 DHEA对TM-3细胞胆固醇含量的影响
• 2.6 DHEA对TM-3细胞StAR mRNA表达水平的影响
• 2.7 DHEA对TM-3细胞P450scc mRNA表达水平的影响
• 2.8 DHEA对TM-3细胞CYP17α mRNA表达水平的影响
• 2.9 DHEA对TM-3细胞3β-HSD蛋白表达水平的影响
• 2.10 DHEA对TM-3细胞17β-HSD蛋白表达水平的影响
• 2.11 DHEA对TM-3细胞芳香化酶蛋白表达水平的影响
• 3 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.2 小结
• Abstract
• 参考文献
• 全文结论
• 本文创新点
• 致谢
• 攻读硕士学位期间论文发表与学术交流情况