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HCMV临床病毒株的分离及其特定基因结构分析和表达研究

2020-11-23阅读(518)

HCMV临床病毒株的分离及其特定基因结构分析和表达研究

论文摘要

目的：1．分离广州地区围产新生儿感染的人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus，HCMV）临床病毒株；2．研究这些低传代HCMV临床病毒株基因组中的特有基因UL136～UL148的结构，分析其结构多态性与HCMV先天性感染致病的关系；3．研究HCMV临床毒株特有基因的表达情况，探讨这些基因编码产物的功能，揭示它们在先天性HCMV感染的致病机制中可能的作用。试图通过这些研究为临床低传代HCMV临床致病机制的研究奠定基础。 方法：1．从广州地区先天性感染HCMV的新生儿尿液中分离野生型HCMV病毒，获取病毒DNA和RNA；2．根据GenBank公布的HCMV低传代毒株Toledo的UL136-UL148等13个基因全序列及有关文献，应用PCR技术扩增这些特有基因片段；3．应用基因克隆技术构建这些特有基因的重组质粒；4．对重组体进行测序；5．应用生物信息学方法分析这些基因结构、及其编码蛋白质的多态性；6．应用RT-PCR技术检测上述基因mRNA的表达情况；7．并分析其编码产物的基本性质和特征。 结果：1．成功分离获得4株HCMV临床低传代病毒株：HCMV D3、D2、D52、C30；2．以HCMV D3临床毒株为研究主体，应用PCR技术成功扩增出UL136～UL148特有区域的全部13个基因，同时扩增其他临床毒株的相应基因，获得上述毒株的13个特有基因的总共32个全基因序列；3．克隆测序，序列呈报GenBank，收录序列号为：DQ180354～DQ180391；4．对临床毒株的这些基因及其编码的蛋白质进行同源性比较分析，发现大部分基因较为保守，具有相对稳定的序列，同时又具有较为丰富的多态性；5．从C30野生毒株中能检测到UL137、UL142、UL144、UL145和UL148等5个基因存在mRNA水平的表达。 结论：1．广州地区围产新生儿感染HCMV的临床毒株基因组中，存在着实验病毒株所缺失的UL136～UL148等13个独特基因结构，并且具有较为丰富的多态性。2．本研究初步证实了其中UL137、UL142、UL144、UL145、UL148等5

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 1.简介
  • 2.研究背景
  • 2.1 HCMV的生物学特征
  • 2.2 HCMV感染导致的疾病
  • 2.3 HCMV感染的诊断、治疗和预防
  • 3.人巨细胞病毒先天性感染
  • 3.1 人巨细胞病毒宫内感染的研究进展
  • 3.2 先天性巨细胞病毒感染对胎儿的影响
  • 3.3 人巨细胞病毒宫内感染对胎婴儿生长发育的影响
  • 3.4 先天HCMV感染导致胎儿先天畸形的发病机制
  • 3.5 先天性巨细胞病毒感染引起胎儿脑神经损伤的机制
  • 4.目前关于HCMV临床低传代病毒株研究存在的问题
  • 5.本研究的目的和意义
  • 第二章 实验仪器与材料
  • 1.主要仪器
  • 2.实验材料
  • 2.1 细胞和菌种质粒
  • 2.2 主要试剂
  • 2.3 主要试剂的配方
  • 2.4 克隆型载体图谱
  • 第三章 实验方法
  • 1.HCMV的分离和培养
  • 1.1 病例来源与选择
  • 1.2 标本收集与处理
  • 1.3 病毒的分离
  • 1.4 病毒的培养
  • 2.病毒DNA的提取
  • 3.HCMV总RNA的提取
  • 4.HCMV RNA的纯化
  • 5.HCMV mRNA逆转录成cDNA
  • 6.PCR反应的进行
  • 7.回收纯化PCR或酶切产物
  • 8.PCR产物和载体质粒的酶切
  • 9.连接反应
  • 10.连接产物转化宿主大肠杆菌
  • 11.重组子的快速鉴定
  • 12.质粒抽提
  • 13.核酸及蛋白质序列比对与分析预测
  • 第四章 结果与分析
  • 1.HCMV临床低传代病毒株的体外培养、分离和鉴定
  • 1.1 人胚肺成纤维细胞培养结果
  • 1.2 感染病毒后人胚肺细胞出现病变效应
  • 1.3 HCMV临床低传代病毒株的鉴定
  • 1.4 小结
  • 2.HCMV临床低传代病毒株特有基因组区域的基因扩增
  • 2.1 HCMV临床低传代病毒株特有基因组区域的PCR分析的引物设计
  • 2.2 HCMV临床低传代病毒株特有基因组区域的PCR扩增结果
  • 2.3 小结
  • 3.HCMV临床低传代病毒株特有基因的克隆
  • 3.1 HCMV临床低传代病毒株特有基因UL136基因的克隆
  • 3.2 HCMV临床低传代病毒D3株特有基因UL137-UZ148等12个相关基因的克隆
  • 3.4 人巨细胞病毒临床低传代病毒株特有基因UL136-UZ148基因的克隆测序
  • 3.5 小结
  • 4.HCMV临床低传代病毒株特有基因UZ136-UZ148的多态性分析
  • 4.1 UL136基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.2 UL137基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.3 UL138基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.4 UL139基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.5 UL140基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.6 UL141基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.7 UZ142基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.8 UL143基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.9 UL144基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.10 UL145基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.11 UL146基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.12 UL147基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.13 UL148基因及其编码蛋白的多态性分析
  • 4.14 小结
  • 5.人巨细胞病毒临床低传代病毒株特有基因序列的表达及其编码蛋白质的分析研究
  • 5.1 人巨细胞病毒总RNA的纯化
  • 5.2 利用RT-PCR检测人巨细胞病毒临床低传代病毒株特有基因序列的表达
  • 5.3 小结
  • 第五章 讨论
  • 1.人巨细胞病毒临床病毒株的分离和培养
  • 1.1 人巨细胞病毒宿主细胞的选择
  • 1.2 样本选择
  • 1.3 病毒培养
  • 1.4 病毒传代
  • 1.5 病毒鉴定
  • 2.人巨细胞病毒临床毒株特有区域的基因结构分析
  • 2.1 人巨细胞病毒临床低传代病毒株特有基因组区域的PCR分析
  • 2.2 人巨细胞病毒临床低传代病毒株特有基因的序列分析
  • 3.人巨细胞病毒临床毒株特有基因的表达
  • 4.研究结论
  • 5.研究创新点及不足之处
  • 6.研究展望
  • 第六章 参考文献
  • 第七章 附录
  • 附录1 人巨细胞病毒低传代临床病毒株UL136～UZ148的DNA和蛋白质序列
  • 附录2 人巨细胞病毒临床低传代病毒UL136～UL148基因重组质粒鉴定图谱
  • 附录3 人巨细胞病毒临床低传代分离株特有基因克隆结果列表
  • 附录4 综述:抗人巨细胞病毒药物及其治疗研究进展
  • 附录5 在校期间公开发表的论文、著作、科研项目
  • 致谢

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