苏云金芽孢杆菌8010 inhA基因的表达和性质研究

论文摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性产孢细菌，能形成杀虫晶体蛋白、外毒素、几丁质酶、营养期杀虫蛋白和蛋白酶等多种毒素，对多种昆虫以及线虫、螨类和原生动物都有活性。其中免疫抑制因子A（Immune Inhibitor A，简称为InhA）是一种含锌金属蛋白酶，能特异性地水解宿主昆虫产生的抗菌肽，因而对某些昆虫的体液免疫系统具有高抗性。到目前为止，对于InhA主要功能的研究仍未获得任何确切性的结论。为了进一步加深对inhA基因及其编码蛋白的认识，我们从Bt 8010中克隆了该基因，并对推导的InhA蛋白做了一系列的序列分析。同时我们也将该基因在大肠杆菌中表达，并对表达产物的杀虫活性做了检测。Bt 8010中克隆得到的inhA基因（命名为inhA-8010）全长2391 bp，编码796 Aa的蛋白，该蛋白分子量和等电点通过软件预测分别为86.5 kDa和5.22。inhA-8010已在GenBank上登录，登录号为AY945956。在线BLAST软件分析表明推导的InhA-8010与蜡质芽孢杆菌属各成员的InhA蛋白具有很高的氨基酸序列同源性。信号肽分析说明InhA-8010的成熟加工剪切位点在第31-32的Ala-Glu之间，说明InhA是一种跨膜蛋白。用在线Conserved Domain Search工具进行保守功能区分析，推导出InhA-8010蛋白质一级结构功能域主要包含有：肽酶M6（peptidaseM6，649Aa）和细菌中未知功能的蛋白（760Aa）。将InhA-8010与Bt 407的InhA进行比较，可以发现它们的氨基酸组成中都不含半胱氨酸，并且氨基酸序列中都包含锌结合基序（HEXXH），后者是含锌金属蛋白酶家族成员所共有的特点。此外，通过将inhA-8010与pGEX-4T-3表达载体连接，构建了重组表达载体pGEXinhA，并成功转入大肠杆菌E．coli BL21（DE3）。阳性克隆子通过PCR和核酸测序得以验证。inhA-8010在tac启动子调控下经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析说明表达的融合蛋白（包含26 kDa GST）为110 kDa左右，与ExPASy软件预测的基本一致。生物测定表明表达产物对3龄小菜蛾幼虫具有杀虫活性，并且对其生长也表现出较明显的抑制作用。蛋白可溶性试验说明该表达产物部分可溶。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• I 引言
• 1.1 Bt研究概况
• 1.2 重要生物活性物质及其作用方式
• 1.2.1 杀虫晶体蛋白
• 1.2.2 苏云金素
• 1.2.3 营养期杀虫蛋白
• 1.2.4 几丁质酶
• 1.2.5 双效菌素
• 1.2.6 免疫抑制因子 A
• 1.3 InhA研究现状
• 1.3.1 InhA的性质
• 1.3.2 inhA基因的转录、表达和调控
• 1.3.3 InhA的功能
• 1.4 本研究的目的和意义
• II 苏云金芽孢杆菌inhA基因的克隆和序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 总 DNA的提取
• 2.1.2.2 PCR扩增
• 2.1.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.2.4 PCR产物回收和纯化
• 2.1.2.5 连接反应
• 2.1.2.6 转化
• 2.1.2.7 重组子鉴定
• 2.1.2.8 DNA序列测定及分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PCR扩增和重组质粒鉴定
• 2.2.2 序列测定
• 2.2.3 生物信息学分析
• III InhA蛋白的表达和生物测定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 原核表达载体pGEXinhA的构建
• 3.1.2.2 目的蛋白的诱导表达
• 3.1.2.3 生物测定
• 3.1.2.4 目的蛋白的可溶性分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 原核表达载体pGEXinhA的构建
• 3.2.2 目的蛋白的诱导表达
• 3.2.3 生物测定
• 3.2.4 目的蛋白的可溶性分析
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢