新型抗虫ω-芋螺毒素基因MiEN的克隆

论文摘要

芋螺毒素（Conotoxin,CTX）是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺（Conus）分泌出来的,用于麻醉猎物捕食和防御竞争对手的小肽类毒素。芋螺在我国仅存在于南海,是海南特有的药用海洋生物资源。芋螺毒素化学结构新颖,具有特异结合动物各种离子通道的特殊功能,已成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发的新来源。食虫芋螺毒素是开发多肽杀虫剂的宝库。芋螺毒素是一种近乎无限的药物资源。 根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性,可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。再根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位,又可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。其中ω-芋螺毒素（ω-CTX）能特异地阻断并区分动物不同的电压敏感性钙离子通道亚型,已广泛作为神经生物学上的重要分子探针,正应用于相关靶受体的基础研究中,并作为特异的诊断试剂及疗效特异的新药应用于临床。它们的研究与开发十分活跃,是芋螺毒素研究的热点,其Cys残基排列方式为-C-C-CC-C-C-,肽链由24-31个氨基酸组成,分别含有3对二硫键成4-Loop框架。有关抗虫ω-芋螺毒素的研究尚未见报道。 本研究通过采用不同的DNA与RNA提取方法,建立了一套适合芋螺核酸提取的优化方案;利用3’-RACE方法,从海南产勇士芋螺（Conus miles Linnaeus）毒管RNA中分离克隆到一种新型ω-芋螺毒素cDNA,即MiEN基因。根据MiEN基因推测出成熟肽MiEM序列,用Fmoc多肽固相合成法,化学人工合成了毒素肽MiEM。合成的线性肽经氧化折叠纯化后,用于测试其对环境害虫蟑螂（Periplaneta americana）的抗虫活性。结果表明,芋螺毒素肽MiEM对蟑螂具有强烈的致死作用,其半致死剂量LD50为75±6 pmol·g-1,获得了芋螺毒素新基因MiEN的功能信息。本研究为开发新型海洋芋螺毒素多肽杀虫剂提供了新思路和研究基础,在生物农药业中具有广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 芋螺
• 1.1.1 芋螺进入人类历史
• 1.1.2 芋螺生物学特征
• 1.1.3 芋螺的进化
• 1.1.4 芋螺资源
• 1.2 芋螺毒素
• 1.2.1 生物化学
• 1.2.2 分子生物学
• 1.2.3 分类和命名
• 1.2.4 应用领域
• 1.3 芋螺毒素的药理学活性
• 1.3.1 电压门控离子通道阻断剂
• 1.3.2 配体门控离子通道阻断剂
• 1.3.3 其它
• 1.4 芋螺毒素研究现状
• 1.5 展望
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 本研究的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 芋螺材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 芋螺解剖
• 2.2.2 勇士芋螺毒管总RNA的提取
• 2.2.3 勇士芋螺DNA提取方法的优化
• 2.2.4 勇士芋螺总DNA的酶解
• 2.2.5 勇士芋螺RNA反转录合成cDNA
• 2.2.6 ω-芋螺毒素MiEN基因组基因的PCR扩增
• 2.2.7 ω-芋螺毒素基因MiEN cDNA的3’-RACE扩增
• 2.2.8 PCR产物的回收
• 2.2.9 PCR产物的克隆
• 2.2.10 重组子测序
• 2.2.11 测序后重组质粒的中量提取
• 2.2.12 测序后重组质粒酶切和PCR鉴定
• 2.2.13 测序后重组质粒的保存
• 2.2.14 序列分析
• 2.2.15 ω-芋螺毒素MiEM的合成、氧化复性和分离纯化
• 2.2.16 活性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 勇士芋螺形态特征和毒管解剖
• 3.2 勇士芋螺毒管总RNA的提取效果
• 3.3 勇士芋螺毒管cDNA合成的效果
• 3.4 勇士芋螺基因组DNA提取效果
• 3.4.1 四种提取方法的比较
• 3.4.2 勇士芋螺不同组织器官的DNA含量
• 3.5 ω-芋螺毒素基因组基因MiENG的PCR扩增
• 3.6 ω-芋螺毒素cDNAMiEN的PCR扩增
• 3.7 MiEN基因的序列分析
• 3.8 毒素MiEM的化学合成和氧化折叠纯化
• 3.9 毒素MiEM的抗虫活性
• 4 讨论
• 4.1 关于克隆芋螺毒素基因组基因的模板问题
• 4.2 关于用3’-RACE克隆芋螺毒素cDNA的问题
• 4.3 ω-芋螺毒素新基因克隆的策略
• 4.4 抗虫ω-芋螺毒素的应用前景及研究展望
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢