CIP2A在肺癌中的表达及其抑制剂的抗癌作用实验研究

论文摘要

肺癌目前是世界上最常见的恶性肿瘤,每年全世界约有150万新发病例,占所有诊断出的癌症的12%,已经成为威胁人类健康的巨大杀手。虽然目前在肺癌治疗方面取得很大进展,但病人预后率依然很差（5年的生存率低于15%）,因此迫切需要探索新的更有效的治疗方法。CIP2A（磷酸酶PP2A癌性抑制物）最先是在肝癌病人中发现的一种自身抗原,后来研究显示,CIP2A能抑制PP2A介导的c-Myc去磷酸化活性,进而稳定c-Myc,并参与癌细胞的增殖和转化过程。但是,迄今为止,有关CIP2A功能方面的研究以及CIP2A相关通路的调节还远没有阐述清楚。此外,CIP2A在肺癌病人癌组织标本中的表达情况、在肺癌中的功能、能否作为潜在的肺癌治疗靶点以及筛选灭活CIP2A蛋白的化合物用于肺癌的治疗等还有待于深入探讨。本文主要从以上几个方面进行研究。首先,我们用Western blot方法比较了正常的肺组织细胞（胚肺成纤维细胞和正常的支气管上皮细胞）和肺癌细胞系中CIP2A蛋白的表达情况,结果发现CIP2A蛋白在肺癌细胞系中的表达显著高于肺部来源的正常细胞系。接下来,我们在病人标本中验证这一现象。为此,我们采集了60例肺癌病人标本和对应的正常的肺组织,利用Western blot、RT-PCR以及免疫组化方法,我们发现与细胞系的结果一致,CIP2A在肺癌病人癌组织中表达量显著高于癌旁组织,所检测的60例肺癌病人标本中有38例高表达CIP2A,占所检测标本数的63.3%,而在同一病人的癌旁正常组织则检测不到表达或低表达。多元逻辑回归分析显示CIP2A高表达与吸烟显著相关。通过小RNA干扰（siRNA）的方法沉默CIP2A表达,能显著抑制肺癌细胞系的增殖以及克隆形成能力。在此基础上我们尝试寻找能参与调节CIP2A蛋白表达的化合物,结果我们发现中药来源的小分子化合物rabdocoetsin B能从转录水平显著下调CIP2A蛋白,并抑制CIP2A参与调节的Akt信号通路。此外,rabdocoetsin B还可以抑制多种肺癌细胞系的增殖并诱导凋亡。有趣的是,我们还发现另外一个提取自中草药的化合物LTZ010能通过泛素-蛋白酶体通路引起CIP2A的快速降解,且具有很好的体内、外抗肿瘤活性。总之,我们研究结果显示CIP2A蛋白可作为一个有前途的新的肺癌治疗靶点,rabdocoetsin B和LTZ010作为两个能下调CIP2A蛋白的天然化合物,具有潜在的肺癌治疗应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论（文献综述）
• 1.1 非小细胞肺癌的分子靶向治疗研究进展
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 靶向EGFR 信号通路
• 1.1.2.1 EGFR 信号通路概述
• 1.1.2.2 EGFR 基因突变或扩增
• 1.1.2.3 EGFR 抑制剂
• 1.1.3 靶向血管生成信号通路
• 1.1.4 靶向PI3K/Akt/mTOR 信号通路
• 1.1.5 靶向胰岛素样生长因子1 受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-IR）
• 1.1.6 靶向EML4–ALK
• 1.1.7 靶向其它的信号通路或分子
• 1.1.8 结语与展望
• 1.2 Cancerous inhibitor of PP2A（CIP2A）的研究进展
• 1.2.1 前言
• 1.2.2 CIP2A 的发现历史
• 1.2.3 CIP2A 的结构
• 1.2.4 CIP2A 蛋白的生物学功能
• 1.2.4.1 CIP2A 与c-Myc
• 1.2.4 2 CIP2A 与phospho-Akt（p-Akt）
• 1.2.4.3 CIP2A 与细胞的增殖和转化
• 1.2.4.4 CIP2A 与细胞衰老
• 1.2.4.5 CIP2A 与细胞分化
• 1.2.5 CIP2A 与癌症
• 1.2.5.1 CIP2A 与实体瘤
• 1.2.5.2 CIP2A 与白血病
• 1.2.5.3 CIP2A 在癌症中高表达的原因
• 1.2.6 结语与展望
• 第2章 研究结果及讨论
• 2.1 引言
• 2.2 CIP2A 在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达
• 2.2.1 CIP2A 在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达
• 2.2.2 CIP2A 的高表达与吸烟有关
• 2.2.3 CIP2A 对肺癌细胞的增殖和转化起着重要作用
• 2.2.4 小结
• 2.3 Rabdocoetsin B 抑制肺癌细胞中 CIP2A-pAKT 信号通路
• 2.3.1 Rabdocoetsin B 抑制CIP2A 转录引起其蛋白水平的下调
• 2.3.2 RdB 抑制CIP2A 调节的磷酸化AKT 水平
• 2.3.3 RdB 抑制肺癌细胞增殖和诱导凋亡
• 2.3.4 小结
• 2.4 LTZ010 — CIP2A 的另一个抑制剂
• 2.4.1 LTZ010 能引起CIP2A 蛋白的快速降解
• 2.4.2 LTZ010 通过泛素-蛋白酶体通路降解CIP2A 蛋白
• 2.4.3 LTZ010 具有潜在的体内、外抗肿瘤活性
• 2.4.4 小结
• 2.5 分析和讨论
• 第3章 实验材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 肺癌病人标本
• 3.1.2 细胞系和培养条件
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 抗体
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 肺癌病人标本组织的免疫组化分析
• 3.2.2 总RNA 的提取（Trizol 法提取）
• 3.2.3 RT-PCR
• 3.2.4 实时定量PCR
• 3.2.5 蛋白质的提取
• 3.2.6 免疫印迹（Western Blot）
• 3.2.7 考马斯亮蓝染色
• 3.2.8 MTT 比色实验法
• 3.2.9 细胞凋亡检测
• 3.2.10 RNA 干扰
• 3.2.11 平板克隆形成实验
• 3.2.12 软琼脂克隆形成实验
• 3.2.13 裸鼠荷瘤实验
• 3.2.14 细胞培养
• 3.2.15 转化
• 3.2.16 质粒DNA 的小规模制备
• 3.2.17 细胞瞬时转染
• 3.2.18 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）
• 3.2.19 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）
• 3.2.20 放线菌酮（CHX）抑制实验
• 参考文献
• 附录 英文词汇缩略表
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果