大鼠骨髓源性间充质干细胞定向诱导分化为肝细胞的实验研究

论文摘要

骨髓来源的间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨髓内具有多种分化潜能的一类干细胞亚群,并且在一定条件下可以向多种不同组织细胞分化。本论文主要用具有脂肪细胞分化潜能的MSCs,进行向肝细胞定向诱导分化,为肝细胞移植提供可靠的种子来源。目的:分离、纯化、培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;采用损伤肝组织和血清对MSCs进行定向诱导分化,并确定MSCs体外诱导分化为肝样细胞的最佳条件。方法:无菌条件下取周龄大乳鼠四肢骨骨髓,全血培养所得的贴壁细胞用1.077g/mlFICOLL（淋巴细胞分离液）密度梯度离心去除成纤维细胞和残留血细胞,传代,通过控制消化时间得到纯度较高的骨髓MSC。取第三代细胞（P3）,用成脂诱导的方法检测其分化潜能,用损伤肝组织和血清定向诱导分化MSCs,利用免疫细胞化学和RT-PCR等方法对MSCs及诱导后肝样细胞进行细胞特异性标志物的鉴定。结果:1.全血培养的骨髓原代细胞呈细沙样,换液后,贴壁细胞呈集落样生长,细胞贴壁后由于密度的不同而表现不同的形态。当密度较大时,细胞呈梭形,呈旋涡状,放射状或平行状生长。当密度较小时,细胞呈延伸态纺锤形或三角形。密度梯度离心后细胞均质性明显提高,从形态学上看具有MSC的特点。2.传代培养的第三代（P3）MSCs经免疫细胞化学检测CD105呈阳性,提示细胞具有MSC特异性标记。3.MSCs在20%马血清、20%马血清+氢化可的松、DX+IBMX+IS+ID,这些成脂诱导剂均能分化为脂肪细胞,阳性率达到90%以上。油红O结合苏木素染色后可见橘红色的脂肪滴和浅蓝色的细胞核。其中DX+IBMX+IS+ID诱导的脂肪细胞脂滴体积最大,诱导分化时间最短,提示虽然三组诱导环境均可检测MSCs的分化潜能,但DX+IBMX+IS+ID诱导效果最明显。4.损伤肝组织和血清诱导MSCs后,免疫细胞化学染色ALB阳性,糖原染色阳性,RT-PCR可检测出肝特有基因AFP、ALB的表达。混合组ALB及糖原染色阳性率高于单因素组,提示混合组比单因素组能更高效的诱导MSCs向肝细胞分化。结论:1.本实验采用全血培养法和密度梯度离心法对大鼠骨髓MSCs进行分离、纯化、体外培养,同时从细胞形态和生物学特性进行观察和检测,该方法是有效、简便,可获得高纯度MSCs的可靠方法,MSCs在体外不但可进行大量培养扩增,而且其增殖和传代能力很强。2.骨髓MSCs在成脂诱导剂诱导下,可以定向分化为脂肪细胞,阳性率均在90%以上,说明所得到的MSCs具有多向分化潜能。其中DX+IBMX+IS+ID组诱导效果最明显。3.损伤肝组织和血清定向诱导具有脂肪细胞分化潜能MSCs（P3）,分化为肝样细胞,并表达肝细胞的特异性标志物,说明损伤肝组织及血清中存在使MSCs分化为肝样细胞的相关因子或成分。结果提示混合组为MSCs向肝细胞分化提供了更适宜的诱导环境。

论文目录

• 内容提要
• 髓源间充质干细胞的研究进展及展望
• 1. 骨髓MSCs 的生物学特性
• 2. 骨髓MSCs 的分离方法
• 3. 骨髓MSCs的可塑性
• 4. MSCs向肝样细胞分化体外诱导因素的影响
• 5. 研究骨髓MSCs诱导为肝细胞的重要价值及展望
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 1. 大鼠MSCs的形态观察
• 2. 大鼠MSCs表面抗原的鉴定
• 3. 大鼠MSCs分化潜能的检测
• 4. 向肝样细胞分化中的细胞形态观察
• 5. 肝细胞特异蛋白的免疫细胞化学法鉴定
• 6. 糖原合成的检测
• 7. 肝细胞特异基因的表达
• 讨论
• 1. 大鼠BMSCs的分离、培养和纯化
• 2. 大鼠MSCs 的鉴定
• 3. 诱导MSC转化为肝样细胞
• 4. 诱导后肝样细胞特异性标志物检测的意义
• 结论
• 参考文献
• 摘要
• Abstract
• 致谢