水产品中甲砜霉素残留控制研究

论文摘要

甲砜霉素（Thiamphenicol,TAP）是一种广谱抗菌素,其结构类似于氯霉素,能抑制革兰氏阳性细菌、阴性细菌和一些厌氧微生物,广泛应用于水产养殖当中并且会造成残留。因此,研究和建立检测方法成了当务之急。本研究以多克隆抗体和免疫分析技术为基础,根据酶联免疫原理,建立了快速简便的水产品中的酶联免疫检测方法。另外,还建立了相应的仪器检测方法。首先通过混合酸酐法合成甲砜霉素与牛血清蛋白偶联物,构建甲砜霉素完全抗原。通过紫外扫描、SDS-聚丙烯凝胶电泳和免疫动物实验,证明了产物合成成功。通过免疫新西兰白兔,得到抗TAP的抗血清,抗血清效价高达1×106。此抗血清分别经过饱和硫酸铵沉淀法、离子交换法和反向免疫亲和层析法纯化后,得到单一特异性的抗体,平均亲和常数为7.8×10-9 mol/L。以此抗体为基础,设计了间接竞争两步酶联免疫检测方法,并优化了缓冲液浓度、pH、吐温20浓度等参数。此酶联免疫检测试剂盒检测限为0.06 ng/mL,血液和组织回收率为80～110%。通过重复性、检测灵敏度、准确性等指标来评估此方法,并与气相色谱法进行了比较,结果表明,此间接竞争酶联免疫检测方法各项参数均能满足实际检测的需要。建立和优化了甲砜霉素残留的高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC/MS）和气相色谱-质谱法（GC/MS）的检测方法。方法的回收率分别为:HPLC为78.6～95.4%;HPLC/MS为72.6～99.8%;GC/MS为85.6～101.5%,相对偏差均小于10% ,检出限分别为:HPLC为8.3μg/kg;HPLC/MS为0.1μg/kg;GC/MS为0.1μg/kg。结果表明,这些方法都能满足实际检测的需要。以高效液相色谱法（HPLC）为检测方法,研究了甲砜霉素在鲈鱼血液和可食性组织里的消除规律。鲈鱼单次口服5 mg/kg（鱼体）和30 mg/kg（鱼体）的甲砜霉素药物后,药物在血液中的达峰时间分别为6小时和8小时,药物平均滞留时间的分别为11.1小时和11.9小时;甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程:C=10.812(e-0.087t– e-0.274t),药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为1.997 h,消除半衰期为5.589 h;连续5d口服15和30 mg/kg（鱼体）的甲砜霉素,药物的吸收速率是一个常数,它在血液中的消除速率也是一个常数,这和单次口服结果一致,其消除速率方程分别为C血液=0.849e-0.494t;C肌肉=1.461e-0.682t,药物在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为1.016d和1.403d;通过EMEA/CVMP/036/95所规定的统计方法计算休药期,根据95%的忍受限和最大残留限量,确定了5d和6d分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 水产食品产业背景
• 1.2 抗生素残留可能产生的危害性
• 1.3 当前鱼药残留的控制问题
• 1.4 抗生素在水产动物体内消除规律研究进展
• 1.5 食品中TAP 的分析方法
• 1.6 ELISA 快速检测技术的研究进展
• 1.7 立题的目的意义和主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 甲砜霉素完全抗原的合成与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 ELISA 方法的建立与优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 甲砜霉素残留在鲈鱼体内的消除规律
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 总结与展望
• 主要结论
• 主要创新点
• 博士期间发表的论文
• 致谢