大豆苷元抗骨质疏松及其壳聚糖长效缓释微球制剂的研究

论文摘要

大豆苷元（daidzein）来源于天然植物大豆，作为一种异黄酮成分，具有弱雌激素样和抗雌激素样作用，广泛用于心脑血管疾病、癌症、骨质疏松等疾病的治疗和预防，具有疗效好、副作用小等特点。为了进一步了解大豆苷元抗骨质疏松的作用，并制成合适给药的新剂型，本文从细胞学和整体动物两个方面进行大豆苷元抗骨质疏松的实验研究，并以壳聚糖为载体材料，设计和研制了大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球，并采用体内外不同方法对其进行了科学的评价。在培养基中添加β-甘油磷酸二钠、L-抗坏血酸和培养时间10、20、30天条件下，采用MTT比色法、碱性磷酸酶活性测定、Ca和P含量测定、茜素红染色和von Kossa染色，考察不同大豆苷元浓度(10-9～10-5M)对MC3T3-E1成骨样细胞增殖、分化和矿化的影响，结果表明大豆苷元能促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化特别是促进矿化的发生和增加矿化的量；建造去卵巢小鼠骨质疏松模型，选择小鼠进行去卵巢手术后1、3和5周模型，与阳性对照药17β-雌二醇比较，考察腹腔注射大豆苷元溶液对小鼠子宫重量系数、股骨病理切片HE染色的骨组织结构和骨组织中细胞因子OPG、RANKL mRNA相对表达水平的影响，从而初步探讨大豆苷元抗骨质疏松的机理，大豆苷元能改善去卵巢导致的小鼠皮毛蓬松、行动迟缓、反应迟钝和精神不振，能增加去卵巢小鼠的子宫重量系数、骨小梁分布密度和骨皮质厚度，并呈现剂量和时间效应，此外大豆苷元能通过调节OPG／RANKL比例从而调节骨重建过程中破骨细胞和成骨细胞的平衡，说明大豆苷元具有抗骨质疏松的作用，这对于了解植物雌激素抗骨质疏松的作用机制具有重要意义。在制剂处方研究前，建立大豆苷元原药的高效液相分析方法，对原料药的理化性质进行了考察。大豆苷元溶液在强光、温度、不同pH介质中72h内的稳定性研究表明药物含量无明显变化，稳定性较好；测定了大豆苷元在H20、0.1mol／LHCl、pH6.8PBS和pH7.4PBS中的平衡溶解度以及不同pH下正辛醇／水系统中，大豆苷元的表观油水分配系数Papp；原料药的稳定性影响因素实验表明，在露置空气、高湿及40℃、60℃条件下，大豆苷元含量无明显变化，在光照条件下含量略有降低。采用Caco-2细胞体外吸收模型，考察了大豆苷元在不同浓度和不同pH条件下穿单分子层细胞膜的渗透速率和吸收百分数，并对其在Caco-2细胞转运实验中产生的代谢物进行了初步测定，大豆苷元跨单分子层细胞膜的转运不受介质pH和浓度的影响，与仅通过经细胞通道转运的标记化合物普萘诺尔的Papp值相近，预测大豆苷元体内吸收良好，通过β-葡萄糖醛酸酶水解，在转运介质和Caco-2单分子层细胞膜中均能检测到少量代谢物，证明存在葡萄糖醛酸化、硫酸酯化代谢物等。采用乳化／戊二醛交联法制备载药壳聚糖微球，以司盘-80为乳化剂和液体石蜡为油相，大豆苷元经微粉化后以微晶状态混悬于壳聚糖水溶液中为水相，乳化后包裹入乳滴继而交联，形成的微球外形圆整，分散性好，载药量高。经单因素考察筛选出影响微球粒径、粒径分布、载药量及释放快慢的处方因素和工艺条件包括聚合物浓度、药物与聚合物投料比和乳化转速，进一步采用球面对称设计-效应面优化法对其进行优化，经专业统计Statistica进行数据处理。优化的微球中位径、跨距、载药量分别为70.40μm、0.526、30.48％，这些实际测定值与模型方程拟和值偏差较小说明设计和优化结果是成功可靠的。透析袋法释药缓慢，符合表观零级动力学过程。三批样品的重现性试验及稳定性加速试验结果表明，制备的大豆苷元-壳聚糖微球处方稳定、质量可控，达到制剂的设计目的与要求。建立测定肌肉内注射微球后药物残留量的分析方法，小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球后缓慢释药长达35天，突释效应不明显，回收肌肉内注射微球的扫描电镜和注射部位肌肉病理切片表明微球生物组织相容性较好，注射于体内21～35天内发生轻微降解。采用大豆苷元时间分辨荧光免疫分析试剂盒测定血浆内总大豆苷元的浓度，测定大鼠静脉注射大豆苷元溶液和肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球后的体内血浆药时曲线，大豆苷元的体内过程符合二室模型，药物动力学参数k10、t1／2（α）、t1／2（β）、Vc分别为1.17 h-1、0.30h、18.94h、0.46 L／kg。大鼠肌肉内注射微球后血浆药物浓度持久保持35天，其绝对生物利用度为39.02％，较口服大豆苷元有显著性提高。体内外相关性研究表明，微球体内吸收百分数与透析袋释药法测定的体外累积释药百分数有较好的相关性（r=0.9975），微球中药物主要以药物结晶溶解和扩散方式释放，在后期伴有体系降解溶蚀释药特征。建立去卵巢小鼠骨质疏松模型，进行大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球肌肉内注射给药。股骨病理切片HE染色表明，与灌胃大豆苷元混悬液相比，微球组特别是高剂量具有明显改善骨小梁和皮质骨组织结构疏松的作用，提示其在体内药效得到提高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一章 大豆苷元抗骨质疏松的细胞学和整体动物研究
• 一 材料与仪器
• 二 方法与结果
• 1 大豆苷元对MC3T3-E1细胞的实验研究
• 1.1 MC3T3-E1细胞的培养
• 1.2 力豆苷元对MC3T3-E1细胞的增殖作用
• 1.3 大豆苷元对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响
• 1.4 大豆苷元对MC3T3-E1细胞Ca和P含量的影响
• 1.5 大豆苷元对MC3T3-E1细胞钙沉积的影响
• 2 大豆苷元对去卵巢小鼠骨质疏松的实验研究
• 2.1 实验动物和骨质疏松模型的建造
• 2.2 给药方案
• 2.3 对去卵巢小鼠体重、子宫重量系数和股骨湿重的影响
• 2.4 对去卵巢小鼠股骨病理切片的影响
• 2.5 对去卵巢小鼠股骨OPG和RANKL mRNA相对表达水平的影响
• 三 讨论与小结
• 1 讨论
• 2 小结
• 四 参考文献
• 第二章 大豆苷元制剂的处方前研究
• 一 材料与仪器
• 二 方法与结果
• 1 高效液相分析方法的建立
• 2 大豆苷元溶液的稳定性
• 3 大豆苷元平衡溶解度的测定
• 4 大豆苷元表观油/水分配系数的测定
• 5 化学稳定性影响因素试验
• 6 Caco-2细胞用于大豆苷元吸收的研究
• 6.1 Caco-2细胞的培养
• 6.2 大豆苷元对Caco-2细胞的毒性实验
• 6.3 大豆苷元对Caco-2细胞酶活性的影响实验
• 6.4 Caco-2单分子层细胞膜形成的鉴定
• 6.5 顶面侧不同pH介质对大豆苷元溶液转运的影响
• 6.6 顶面侧不同大豆苷元溶液浓度对其转运的影响
• 6.7 大豆苷元代谢物的测定
• 三 讨论与小结
• 1 讨论
• 2 小结
• 四 参考文献
• 第三章 大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球制剂的制备与评价
• 一 材料与仪器
• 二 方法与结果
• 1 壳聚糖微球中大豆苷元含量测定方法的建立
• 2 壳聚糖微球中大豆苷元释放度测定方法的建立
• 2.1 增溶剂对大豆苷元的增溶作用
• 2.2 桨法
• 2.3 透析袋释药法
• 3 微球粒径及其分布和包封率的测定方法
• 4 壳聚糖的释放实验
• 5 大豆苷元-壳聚糖微球的制备方法
• 6 处方和工艺的设计与优化
• 6.1 单因素考察
• 6.2 球面对称设计-效应面优化法设计和优化处方
• 6.3 最优处方的制备和评价
• 7 壳聚糖的释放试验
• 8 大豆苷元-壳聚糖微球的稳定性试验
• 三 讨论与小结
• 1 讨论
• 2 小结
• 四 参考文献
• 第四章 大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球制剂的体内过程研究
• 一 材料与仪器
• 二 方法与结果
• 1 肌肉内注射微球后药物残留量分析方法的建立
• 2 时间分辨荧光免疫分析法测定血浆内大豆苷元的浓度
• 3 小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的体内释药试验
• 4 小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的生物相容性实验
• 5 小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的体内降解实验
• 6 大鼠静脉注射大豆苷元溶液的药物动力学研究
• 6.1 给药方案及血样采集
• 6.2 血药浓度的测定
• 6.3 药物动力学参数的计算
• 7 大鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的药物动力学研究
• 7.1 给药方案及血样采集
• 7.2 血药浓度的测定
• 7.3 绝对生物利用度的计算
• 8 体内外相关性研究
• 9 肌内注射大豆苷元-壳聚糖微球对去卵巢小鼠骨质疏松的影响
• 9.1 去卵巢小鼠骨质疏松模型的制备与给药
• 9.2 对去卵巢小鼠子宫重量系数的影响
• 9.3 对去卵巢小鼠股骨切片 HE染色的影响
• 三 讨论与小结
• 1 讨论
• 2 小结
• 四 参考文献
• 全文结论
• 发表论文
• 致谢
• 附录