胸腺基质淋巴细胞生成素在呼吸道合胞病毒感染诱发哮喘加重中的作用研究

论文摘要

研究背景及意义:支气管哮喘（简称哮喘）是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道疾病,以气道慢性炎症、粘液分泌增加、气道反应性增高及气道重塑为主要特征。哮喘的发生与发展受多种因素的调控,从而决定了淋巴细胞分化,免疫反应类型,细胞因子合成及组织修复过程。尽管哮喘基础研究取得较大的进步,但目前临床上对于哮喘的急性加重以及重症哮喘的治疗仍然不是很满意。随着分子病毒学技术的发展和RT-PCR技术在临床研究中的应用,呼吸道病毒感染作为哮喘加重的最重要原因已被广泛认识。已经证实,病毒诱发的哮喘加重在学龄儿童中的比例约为80%-85%,而在成人中约为60%-75%。呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytial virus,RSV）作为呼吸道单链RNA病毒的一种,是引起小儿呼吸道感染的最常见病原体,也是诱发婴幼儿哮喘的主要原因,在哮喘的发展和加重中被认为是一个重要的危险因子。而且,针对RSV的免疫是不完全的和暂时的,所以已经感染过RSV的成人可以再次被同株的RSV感染。微生物感染对机体的破坏作用导致宿主防御机制的进化。在哺乳动物,有两套防御机制:固有免疫和继发性免疫。固有免疫识别是通过模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）来完成的,每个受体都对微生物的保守和不变的特征识别具有广泛的特殊性。PRRs识别微生物是通过与病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）的结合来完成的。在PRRs的病毒识别中,最具特征性的是Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）。呼吸道上皮细胞除了作为物理屏障,也能通过感受外界刺激因素启动固有免疫反应产生细胞因子,从而影响继发性免疫反应。在针对吸入性外来变应原和病原体的继发性免疫反应的起始中,局部浸润的树突状细胞（dendritic cells,DCs）起到关键性作用。气道上皮细胞影响DCs可以通过DCs激活因子胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin,TSLP）的产生来调控Th细胞的局部分化。研究证实TSLP能诱导DCs调节初始CD4+T淋巴细胞向Th2细胞分化,产生IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α等细胞因子。在对气道上皮细胞生成TSL。P的刺激因子的研究中发现,TLR3的配体双链RNA（dsRNA）与TLR3受体结合产生大量的TSLP mRNA。这提示病毒在呼吸道上皮细胞内复制过程中形成的dsRNA中间体,可能通过TSLP的诱导,加重Th2炎症反应,从而进一步加重哮喘患者气道粘膜炎症。这个推论可以解释为什么呼吸道病毒感染加重变态反应性炎症,而从免疫学理论上讲,病毒诱导的Th1免疫反应能拮抗Th2调节的炎症反应。本项研究主要通过研究RSV感染人支气管上皮细胞16HBE分析固有免疫反应受体TLR3的表达情况及对TSLP生成的影响,通过TLR3抗体阻断的方法研究是否可以引起TSLP的生成的改变,通过模拟气道局部Th1和Th2内环境加入IFN-γ和IL-4观察其对RSV感染诱发的TSLP生成影响,同时观察利巴韦林和地塞米松等药物干预对支气管上皮细胞生成TSLP的影响。为明确TSLP在哮喘动物体内的变化与哮喘的关系,通过RSV感染小鼠哮喘加重模型进一步分析在RSV感染情况下小鼠气道局部TSLP的表达与小鼠肺部炎症的相互关系,并观察不同药物治疗对RSV感染哮喘加重小鼠气道TSLP生成和肺部炎症的影响。方法:一、体外细胞学试验1.不同浓度和不同时间人工合成dsRNA聚肌胞（PolyⅠ:C）对人支气管上皮细胞16HBE表达TSLP mRNA和TLR3 mRNA的影响分别加入含0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml聚肌胞的10%DMEM培养基培养16HBE细胞,刺激3小时,实时荧光定量RT-PCR检测TSLP mRNA和TLR3 mRNA相对表达量。10μg/ml聚肌胞加入10%DMEM培养基培养16HBE细胞,分别刺激1h、2h、3h、6h、12h、24h,实时荧光定量RT-PCR检测TSLP mRNA和TLR3 mRNA相对表达量。2.RSV病毒感染对人支气管上皮细胞16HBE固有免疫受体TLR3表达的影响RSV病毒感染Hep-2细胞进行病毒扩增;RSV在Hep-2细胞质内扩增的间接免疫荧光鉴定;Reed-Muench法测算RSV细胞毒力。RSV感染人支气管上皮细胞16HBE 24小时,间接免疫荧光检测细胞TLR3受体表达变化。3.RSV病毒感染及干预因素对16HBE细胞TSLP mRNA和TLR 3mRNA表达水平和TSLP蛋白表达的影响试验分6组:对照组,RSV组,RSV/Anti-TLR3组,RSV/IFN-γ组,RSV/IL-4组,RSV/地塞米松组;RSV感染6小时后实时荧光定量RT-PCR检测细胞TSLP mRNA和TLR3 mRNA相对表达量;RSV感染24小时后western blotting检测各组细胞TSLP蛋白表达水平。4.利巴韦林抑制RSV病毒感染对16HBE细胞TSLP mRNA表达水平和TSLP蛋白表达的影响试验分4组:对照组,RSV组,RSV/利巴韦林组,利巴韦林组;RSV感染6小时后实时荧光定量RT-PCR检测细胞TSLP mRNA相对表达量;RSV感染24小时后western blotting检测各组细胞TSLP蛋白表达水平。二、动物实验1.RSV病毒感染对哮喘加重小鼠气道TSLP分泌和肺部炎症的影响32只BALB/c小鼠分为4组:A组（对照组）,B组（OVA组）,C组（RSV组）,D组（OVA/RSV模型组）。无创肺功能检测小鼠气道反应性:不同浓度乙酰甲胆碱激发,BUXCO无创肺功能检测仪检测Penh值。小鼠血清ELISA法检测细胞因子:小鼠血清用于IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13细胞因子检测。小鼠气管灌洗液细胞分类计数和ELISA检测TSLP:聚乙烯导管行小鼠气管插管,PBS灌洗,灌洗液上清ELISA法检测细胞因子TSLP;灌洗液离心沉淀细胞计数,瑞氏-吉姆萨染色细胞分类计数。小鼠肺脏组织病理观察:苏木素—伊红（HE）染色观察小鼠肺脏病理变化;碘酸雪夫（PAS）染色观察气道上皮细胞粘液合成。小鼠肺脏组织免疫组化观察气道上皮细胞TSLP表达,DAB显色,阳性显示棕黄色。小鼠肺脏组织TSLP蛋白western blotting检测,Gel-Pro ANALYZER4.5软件分析TSLP的相对表达量。2.不同药物治疗对RSV感染哮喘加重小鼠TSLP分泌和肺部炎症的作用32只BALB/c小鼠分为4组:对照组（0VA/RSV组）,聚肌胞组（OVA/RSV/PolyI:C组）,利巴韦林组（OVA/RSV/Rib组）,地塞米松组（OVA/RSV/Dex组）。无创肺功能检测小鼠气道反应性;小鼠血清ELISA法检测细胞因子血清IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13浓度;小鼠气管灌洗液细胞分类计数和ELISA检测气管灌洗液TSLP浓度;小鼠肺脏组织病理观察;小鼠肺脏组织免疫组化观察TSLP表达;小鼠肺脏组织TSLP蛋白western blotting检测。（方法同上）。三、统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差（（?）±s）表示。各组间多重比较采用单向方差分析（one-way ANOVA）,方差齐性时采用LSD法和SNK法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验。以P＜0.05为有统计学意义。结果:一、体外细胞学试验结果1.随着聚肌胞浓度增加,16HBE细胞TSLP mRNA和TLR3 mRNA表达水平增高。当聚肌胞浓度为50μg/ml时,TSLP mRNA表达量最高,为对照组的29.84±5.32倍（P＜0.01）;TLR3 mRNA表达量最高,为对照组的4.46±0.8倍（P=0.001）。随着聚肌胞刺激时间延长,16HBE细胞TSLP mRNA和TLR3 mRNA表达水平先升高,后下降。当聚肌胞刺激3h,TSLP mRNA表达量达到最高（为聚肌胞刺激1h表达量4.48±0.35倍）（P＜0.001）,随着时间延长TSLP mRNA表达下降;当聚肌胞刺激3h,TLR3 mRNA表达量达到最高（为聚肌胞刺激1h表达量1.66±0.12倍）,随着时间延长TLR3 mRNA表达下降。2.Hep-2细胞接种RSV后第5天细胞大片融合,并有细胞脱落;收集病毒,调整病毒毒力MOI为2;间接免疫荧光观察显示RSV在细胞内扩增;16HBE细胞接种RSV病毒24小时后间接免疫荧光观察细胞内TLR3受体表达情况显示:病毒感染细胞内TLR3受体表达明显增加,而阴性对照组细胞TLR3表达相对少。3.RSV感染16HBE细胞可使细胞TSLP mRNA表达水平增高（为对照组表达量1.63±0.08倍）（P＜0.001）,TLR3 mRNA表达水平增高（为对照组表达量1.54±0.34倍）（P=0.094）。加入重组人IFN-γ100μg/L,TSLP mRNA表达水平为对照组的0.83±0.18倍,比RSV组低（P＜0.001）,TLR3 mRNA表达与RSV组比较无统计学意义（P=1.000）;加入重组人IL-4 100μg/L,TSLP mRNA表达水平为对照组的2.61±0.45倍,比RSV组高（P=0.025）,TLR3 mRNA表达与RSV组比较无统计学意义（P=1.000）;加入Anti-TLR3阻断TLR3受体后细胞TSLP mRNA表达量（为对照组的1.23±0.2倍）相对于RSV感染组低（P=0.034）,而TLR3 mRNA表达水平增高（为对照组细胞为2.06±0.5倍）。加入地塞米松,TSLP mRNA表达量比RSV组低（P＜0.001）,而TLR3 mRNA表达水平相对于对照组仍高（P=0.042）,与其它各组比较均无统计学意义（P＞0.05）。RSV感染组细胞TSLP蛋白相对表达量（1.55±0.36）约为对照组的1.9倍（P＜0.001）,加入IFN-γ可以降低RSV感染引起的TSLP表达升高（1.13±0.31）（与RSV组比较P=0.020）,加入IL-4可以协同RSV感染引起TSLP表达升高（1.99±0.37）,比RSV组表达量增加（P=0.014）,加入TLR3抗体阻断TLR3受体可使TSLP表达降低（1.28±0.28）,但与RSV感染组比较无统计学意义（P=0.114）,加入地塞米松可以显著抑制RSV感染16HBE细胞TSLP表达（0.53±0.11）（与RSV组比较P＜0.001）。4.RSV感染16HBE细胞可以使细胞TSLP mRNA表达水平增高（为对照组的1.99±0.25倍）（P=0.001）;加入利巴韦林抑制RSV感染后TSLP mRNA表达水平下降,为对照组的1.41±0.18倍（P=0.012）;利巴韦林治疗组细胞TSLP mRNA表达水平比RSV感染组低（P=0.006）。利巴韦林可以显著抑制RSV感染引起的TSLP表达（1.16±0.17）,与RSV组（1.97±0.19）比较有统计学意义（P＜0.001）,但仍高于对照组（P=0.002）,单独加入利巴韦林（0.99±0.15）与对照组细胞TSLP表达量比较无统计学意义（P=0.215）。二、动物实验结果1.随着乙酰甲胆碱浓度上升各组小鼠气道反应性检测指标Penh值均出现上升趋势,OVA/RSV组小鼠的气道反应性最高。乙酰甲胆碱激发浓度为3.125 mg/ml时,OVA/RSV组小鼠气道反应性Penh值（128.42±18.05）和OVA组（114.73±17.67）比对照组（19.48±4.44）高（P＜0.001）;乙酰甲胆碱激发浓度为6.25mg/ml时,OVA/RSV组Penh值（318.66±50.87）大于OVA组（187.95±38.73）（P＜0.001）,各药物治疗组小鼠气道反应性Penh值均低于OVA/RSV组（P＜0.01）。当乙酰甲胆碱激发浓度为50 mg/ml时,各治疗组小鼠气道反应性Penh值均低于OVA/RSV组（1335.46±196.61）（P＜0.05）,地塞米松组（581.28±58.89）最低,与其它治疗组比较低（P＜0.001）。2.OVA/RSV组小鼠血清IL-4浓度（274.24±103.67 pg/ml）比OVA组（94.18±26.4 pg/ml）高（P=0.001）,聚肌胞组、利巴韦林组、地塞米松组均可降低血清IL-4水平（P＜0.05）;地塞米松组（86.78±27.04 pg/ml）为治疗组内最低;OVA/RSV组小鼠血清IL-5（293.25±46.13 pg/ml）高于OVA组（239.57±33.84pg/ml）（P=0.003）,各药物治疗组均比OVA/RSV组降低（P＜0.05）,利巴韦林组IL-5水平（220.82±30.9 pg/ml）最低;OVA/RSV组小鼠血清IL-13（330±93.5pg/ml）比OVA组（187.04±62.66 pg/ml）高（P=0.02）,聚肌胞组（219.91±60.88 pg/ml）、地塞米松组（194.65±73.27 pg/ml）均下降（P=0.008,P=0.001）;OVA/RSV组小鼠血清IFN-γ（30.08±5.73 pg/ml）比OVA组（8.46±2.86 pg/ml）明显增高（P＜0.001）,利巴韦林组（12.98±3.34 pg/ml）、地塞米松组（17.33±3.06 pg/ml）均有所下降（P＜0.01）。3.小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中:OVA/RSV组细胞总数（21.23±0.54）×106/ml最多（P＜0.001）,各治疗组细胞总数均降低（P＜0.001）;OVA/RSV组嗜酸性粒细胞数（4.87±0.37）×105/ml最多（P＜0.001）,各治疗组均降低（P＜0.01）;OVA/RSV组淋巴细胞数（5.45±0.16）×105/ml升高最为明显（P＜0.001）,利巴韦林治疗组与之比较无统计学意义（P=0.051）,余各治疗组下降;OVA/RSV组中性粒细胞（2.46±0.25）×105/ml升高最为明显,与OVA组比较有统计学意义（P＜0.01）,聚肌胞组、地塞米松组有所下降（P=0.01,P=0.011）,利巴韦林治疗与OVA/RSV组比较无统计学意义。支气管肺泡灌洗液检测TSLP结果:OVA/RSV组小鼠支气管肺泡灌洗液TSLP（2.13±0.05 ng/ml）高于OVA组（1.99±0.05 ng/ml）（P=0.001）,各药物治疗均使TSLP水平下降（P＜0.01）。4.常规HE染色OVA/RSV组支气管上皮增生肥厚、粘液分泌增加、管腔明显狭窄,管壁及其周围大量淋巴细胞浸润,比OVA组加重,各治疗可使炎症减轻,地塞米松治疗组炎症反应最轻。PAS染色OVA/RSV组粘液分泌增加,杯状细胞增生最为明显,各治疗可一定程度减轻病变,地塞米松治疗组明显抑制上皮细胞粘液合成。免疫组化观察OVA/RSV组小鼠气道上皮细胞表达TSLP最为明显,各治疗组可减轻TSLP合成分泌。5.Western blotting检测发现OVA/RSV组小鼠肺脏TSLP相对表达量（TSLP/GAPDH）（0.93±0.18）为最高,与对照组、OVA组、RSV组比较有统计学意义（P＜0.001,P=0.045,P=0.001）;利巴韦林组小鼠肺脏TSLP表达量低于OVA/RSV组（P=0.031）,地塞米松组为各治疗组中TSLP表达量最低,（P＜0.001）。结论:1.dsRNA可以激活人支气管上皮细胞16HBE固有免疫受体TLR3,促进TSLPmRNA表达量增加。2.RSV感染后病毒复制促进固有免疫受体TLR3在人支气管上皮细胞16HBE内的表达。3.RSV感染促进16HBE细胞表达TSLP;IFN-γ可起到抑制作用,IL-4则起到协同作用促进TSLP表达,表明不同Th1/Th2微环境对TSLP的表达有不同影响;TLR3受体阻断可以适度抑制TSLP表达,间接表明固有免疫受体TLR3在RSV感染的TSLP表达中起到一定作用;地塞米松可以显著降低RSV感染引起的TSLP表达,说明糖皮质激素在RSV感染引起的TSLP表达中起到抑制作用。4.利巴韦林抗病毒治疗可以有效抑制16HBE细胞表达TSLP,说明抑制RSV在细胞内复制可以起到减少细胞表达TSLP的作用。5.RSV感染可以促进OVA过敏性哮喘小鼠气道上皮细胞生成TSLP增加,并加重肺部炎症反应。6.聚肌胞、利巴韦林和地塞米松药物治疗在一定程度上可以抑制RSV感染哮喘加重小鼠气道上皮细胞生成TSLP的增加,减轻小鼠肺部炎症反应,其中以地塞米松的相对作用最强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 试验步骤简图
• 第1章 呼吸道合胞病毒感染对人支气管上皮细胞16HBE生成胸腺基质淋巴细胞生成素的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 第2章 呼吸道合胞病毒感染对哮喘小鼠气道分泌TSLP和肺部炎症的影响
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 第3章 不同治疗措施对RSV感染哮喘加重小鼠气道分泌TSLP和肺部炎症的影响
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 攻读博士期间主要成果
• 致谢
• 统计学证明