肌腱干细胞和间质细胞衍生因子复合蚕丝—胶原支架促进肌腱再生的研究

论文摘要

背景：随着我国国民素质的提高以及人们对健康体魄的向往,国人参加体育锻炼和竞赛活动的数量明显增加,运动损伤也越来越多,其中韧带肌腱损伤占50%以上当前,自体移植、同种异体移植、异种移植和假体材料修复术经常用于修复韧带和肌腱损伤。然而,这些手术重建再生技术有不同的弊端,例如供体部位并发症、疾病传播、免疫排斥和较差的支架整合性。近10年,随着组织工程的兴起,临床医学正步入一个“再生医学”的新阶段。在组织的修复过程中,种子细胞占据了很重要的成分。常用种子细胞包括肌腱韧带中的成纤维细胞,皮肤来源的成纤维细胞,骨髓间充质干细胞（BMSCs）,胚胎干细胞（ESCs）和诱导的多能干细胞（IPSs）等。这些细胞有自己的优势,同时也存在着一定的弊端,如细胞外基质排列还显紊乱,修复部位的骨化,一定的畸胎瘤发生率。最近,研究者们从肌腱组织中分离出了一种新型的干细胞,称之为肌腱干/祖细胞（TSPCs）。这些细胞不仅有像Msc一样的干细胞特性,而且高表达肌腱相关的基因和蛋白质。这些结果提示肌腱来源的肌腱干细胞（TSPCs）有修复损伤肌腱的潜能。除了外源性的种子细胞,机体内部（内源性）的细胞动员也是促进损伤组织修复的一个重要方面。在肌腱的生长、发育、损伤和修复过程中,有很多的生长因子和细胞因子参与了活动。如血小板相关生长因子BB （PDGF-BB）、胰岛素样生长因子（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF--β）家族等。在我们之前的细胞治疗研究中,我们发现转化生长因子-beta3 （TGF-beta）,生长分化因子5（GDF5）,骨形态发生蛋白2 （BMP2）, bFGF和间质细胞衍生因子（SDF-1）等在损伤部位含量升高。Minami和他的同事们的一项最近研究阐明了SDF-1的局部表达增加可以促进BMSCs在系统注入后在损伤位点的迁移。我们认为局部释放的SDF-1可以调节损伤韧带和肌腱的修复。鉴于肌腱组织需要承受强大的力学,在损伤肌腱的组织工程中,我们需要通过支架材料复合干细胞或是生长因子/细胞因子等手段来促进身体已损伤组织的再生。在我们之前的研究工作中,我们把蚕丝和胶原海绵复合在一起,构建出了一个实用的肌腱组织工程支架。然而修复肌腱的结构和功能与正常肌腱相比较,还是相差甚远。一种理想的、能吸引目的细胞在损伤部位集聚的有生物活性的蚕丝支架的组合仍然面临着巨大的挑战。在此研究中,我们将蚕丝-胶原支架作为TSPCs和SDF-1体内移植的载体,通过两者的复合,来研究复合蚕丝-胶原支架能否进一步促进损伤肌腱的修复。我们的研究将为损伤肌腱的修复带来一种新的方式。我们的研究分为三部分：（1）种子细胞（TSPCs）的分离和鉴定（2） TSPCs复合蚕丝-胶原支架构建组织工程肌腱,评估TSPCs对肌腱损伤修复的促进作用；（3）间质细胞衍生因子（SDF-1）复合蚕丝-胶原支架构建组织工程支架用于损伤肌腱的修复,评估SDF-1趋化的内源性细胞对肌腱损伤修复的促进作用：第一章种子细胞（TSPCs）的分离和鉴定目的：肌腱干细胞是近几年发现的,来源于肌腱组织的干细胞。本部分的目的是研究肌腱干细胞的分离及三系分化能力的鉴定。方法与结果：体外试验中,我们评估了肌腱干细胞的克隆形成能力和三系分化能力。结果显示肌腱干细胞显示了干细胞的一般特性,如克隆形成能力,增殖能力强和多系分化能力等。结论：来源于肌腱组织的肌腱干细胞（TSPCs）具有干细胞的一般特性,可能是体内肌腱修复的理想外源性种子细胞来源。第二章肌腱干细胞复合蚕丝-胶原支架促进肩袖韧带修复目的：研究肌腱干细胞复合蚕丝-胶原支架能否促进肩袖韧带的修复。方法与结果：体外试验中,我们评估了肌腱干细胞在材料表明的生长,增殖,肌腱相关基因表达情况。在体内试验中,我们选择兔子肩袖损伤作为动物模型,将肌腱干细胞种植于蚕丝-胶原支架上后移植入兔子体内评估其修复效果。结果显示肌腱干细胞显示了干细胞的一般特性,如克隆形成能力,增殖能力强和多系分化能力等。体外种植的肌腱干细胞在蚕丝-胶原支架上增殖良好,无细胞毒性。体内细胞移植结果显示移植的细胞-支架没有引发免疫反应,相反,在术后4周和8周的时间点,其促进了更多成纤维样细胞的长入,减少了炎症细胞的浸润。术后12周,肌腱干细胞处理的实验组比单纯支架的对照组表现为更多胶原组织的沉积,更好的胶原结构和力学特性。结论：移植的肌腱干细胞通过分化为肌腱细胞和释放抗炎症因子抑制炎症反应等来促进损伤肩袖组织的修复。因此,肌腱干细胞复合的蚕丝-胶原支架是具有一定的临床应用价值的肌腱组织工程支架。第三章外源性间质细胞衍生因子-1（SDF-1）复合蚕丝-胶原支架协同增强损伤肌腱的再生目的：本研究目的是通过复合外源性的间质细胞衍生因子来构建一种具有生物活性的、能选择性促进内源性细胞迁移的蚕丝-胶原支架用于损伤肌腱的修复。方法与结果：在体外,我们评估了外源性间质细胞衍生因子（SDF-1）对大鼠骨髓间充质细胞（BMSCs）、皮下成纤维细胞（HDFs）和跟腱细胞（ATFs）的转移和相关基因表达的影响,构建的支架促进肌腱再生的效率在大鼠体内跟骨腱（AT）损伤模型中测定。体外结果显示BMSCs和HDFs的CXCR4基因表达和细胞迁移对外源性SDF-1敏感,而HDFs和ATFs的肌腱相关基因表达对外源性SDF-1更敏感。在大鼠AT损伤模型中,术后4天和1周外源性SDF-1在损伤部位可以减少炎症细胞的浸入、加强成纤维状的细胞转移。4周后,SDF-1处理的实验组较单纯材料的对照组表现为内源性SDF-1和肌腱相关基因表达提高、产生更好的胶原结构,更粗的胶原和更大的生物力学特性。结论：这项研究阐明了外源性SDF-1和编织蚕丝-胶原海绵支架协同作用可以通过增加内源性成纤维状细胞的集聚、加强局部内源性SDF-1和肌腱细胞外基质的生成、减少炎症细胞的积累来提高肌腱再生的效率。因此外源性SDF-1复合编织蚕丝-胶原海绵支架为韧带和肌腱组织工程提供了一种实用性方法。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 目次
• 绪论
• 1 第一章肌腱干细胞的分离和鉴定
• 1.1 引言
• 1.2 实验试剂与仪器
• 1.2.1 材料和试剂（如无特殊说明均为invitrogen产品）
• 1.2.2 实验仪器及材料
• 1.2.3 相关溶液的配置
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 TSPCs细胞培养
• 1.3.2 TSPCs鉴定
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 TSPCs的分离和特性
• 1.5 讨论
• 2 第二章 TSPCs复合蚕丝-胶原支架促进肩袖韧带修复
• 2.1 引言
• 2.2 实验试剂与仪器
• 2.2.1 材料和试剂（如无特殊说明均为invitrogen产品）
• 2.2.2 实验仪器及材料
• 2.2.3 相关溶液的配置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蚕丝胶原海绵复合支架制作
• 2.3.2 胞在支架上种植和培养
• 2.3.3 实时荧光定量PCR（real time PCR）
• 2.3.4 提取RNA
• 2.3.5 逆转录合成cDNA
• 2.3.6 引物设计
• 2.3.7 电镜扫描（SEM）
• 2.3.8 细胞增殖检测
• 2.3.9 损伤肌腱模型
• 2.3.10 力学测试
• 2.3.11 组织学检测
• 2.3.12 胶原含量测定
• 2.3.13 免疫组化
• 2.3.14 统计学分析
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 TSPCs在蚕丝-胶原支架上的生长及形态
• 2.4.2 肌腱相关基因表达
• 2.4.3 体内跟腱修复
• 2.5 讨论
• 3 第三章SDF-1复合蚕丝-胶原支架协同增强损伤肌腱的再生
• 3.1 引言
• 3.2 实验试剂与仪器
• 3.2.1 材料和试剂（如无特殊说明均为invitrogen产品）
• 3.2.2 实验仪器及材料
• 3.2.3 实验动物
• 3.2.4 相关溶液的配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 MSCs,HDFs和ATFs细胞培养
• 3.3.2 体外SDF-1处理
• 3.3.3 Transwell检测
• 3.3.4 SDF-1-蚕丝-胶原支架制作
• 3.3.5 蛋白质释放曲线
• 3.3.6 损伤肌腱模型
• 3.3.7 透射电镜检测组织工程肌腱的胶原纤维微观结构
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 支架特性
• 3.4.2 胞基因表达受外源性SDF-1刺激的影响
• 3.4.3 体外迁移实验
• 3.4.4 体内跟腱修复
• 3.5 讨论
• 4 总结
• References
• 综述
• 参考文献