柑橘阶段性发育相关基因FLC的功能分析

论文摘要

柑橘是我国重要的经济作物,但由于童期长达6-8年以上,严重制约了其育种进程和重要经济性状,如果实品质和成熟期等遗传机制的研究。前人研究表明,柑橘花芽分化需要冬季低温条件。FLC是低温春化调控成花的核心基因。本实验室前期已从枳中克隆了FLC的同源基因PtFLC。PtFLC拥有5个剪切本,分别在早实枳的不同发育阶段表达。为研究PtFLC在枳阶段发育中的作用,本研究采用RNAi技术,对枳进行遗传转化,抑制PtFLC基因的表达,分析RNAi植株相关基因的表达动态。主要结果如下：1.RNAi载体的构建及枳的遗传转化经序列比对发现,PtFLC的5个剪切本5’端的第一个外显子比较保守,其中209bp的保守片段确定为本研究采用的干涉目的片段。通过在目的片段两端添加重组位点,利用Gateway技术将目的片段一步克隆到位,成功构建了双元干涉载体PHG-FLC。此载体能够编码ihpRNA结构,具有较高的干涉效率。利用农杆菌介导的转化,将干涉载体导入枳上胚轴,并进行再生,通过抗性筛选,最终获得了6个株系的阳性苗。2.RNAi植株PtFLC表达分析通过对6个转基因株系进行实时定量分析,转基因株系L19、L84、L85、L88和L90中PtFLC的表达量与对照植株相比,均有不同程度降低,其中L84和L90的表达量最低,只有对照的0.2倍,表明这两个株系对PtFLC的RNA干涉是成功的。3.RNAi植株表型分析和PtSOCl、PtFT的表达分析目前转基因苗还处于幼苗阶段,其表型观察尚未发现与对照在形态上的不同。对PtSOCl和PtFT的表达水平定量分析结果表明,RNAi植株中PtSOC1和PtFT的表达量升高,且其表达水平变化与PtFLC呈负相关,证明了PtFLC对下游基因的表达发生了影响,也表明干涉是成功的,更多的表型有待进一步观察。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 植物的成花诱导
• 1.1.1 成花调控中的关键基因
• 1.1.2 模式植物拟南芥FLC的功能
• 1.1.3 其他物种中FLC的研究进展
• 1.2 RNA沉默的研究
• 1.2.1 RNA沉默的机制
• 1.2.2 RNA沉默的途径
• 1.2.3 RAN沉默的效率
• 1.2.4 RNAi的特点
• 1.2.5 RNAi的应用前景
• 1.3 本研究的目的和内容
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试植株材料
• 2.1.2 供试农杆菌和载体
• 2.1.3 主要试剂和药品
• 2.1.4 主要培养基配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 播种
• 2.2.2 干涉载体的构建
• 2.2.3 枳遗传转化及再生
• 2.2.4 转基因苗DNA的提取
• 2.2.5 阳性苗的鉴定
• 2.2.6 荧光定量PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 PtFLC基因各转录本间保守序列分析
• 3.2 干涉载体的构建
• 3.2.1 载体构建过程
• 3.2.2 载体的鉴定
• 3.3 干涉载体转化枳
• 3.4 转化苗的分子鉴定
• 3.5 目的基因PtFLC的表达量变化
• 3.6 干涉植株的表型观察
• 3.7 PtSOC1和PtFT的表达分析
• 4 讨论
• 4.1 RNAi载体的构建
• 4.2 枳的遗传转化
• 4.3 PtFLC的功能及表达模式
• 4.4 FLC对下游基因的调控作用
• 4.5 下一步研究的方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢