孕妇外周血中胎儿有核红细胞在DMD胎儿产前基因诊断中的应用研究

论文摘要

背景:目前已确定孕妇外周血中存在胎儿细胞,这就为利用胎儿细胞进行产前诊断提供了一种无创伤性的诊断方法,可在不干扰胎儿宫内生长的前提下获取胎儿细胞,从而可避免羊膜腔穿刺,绒毛活检,胎儿宫内取血等方法对孕妇和胎儿的危害,具有取材方便,风险小,不受孕妇年龄病史等影响的优点。近年来研究发现胎儿有核红细胞是最理想的用于产前诊断的胎儿细胞。然而由于胎儿有核红细胞在孕妇外周血中较少（1:107108）,故对其进行富集、纯化是进行胎儿性别和遗传性疾病产前诊断的先决条件。目前常见的分离纯化方法有:磁激活细胞拣选法（MACS）,流式细胞技术,荧光细胞拣选法（FACS）等。但这些方法都需要特异性抗体,而胎儿有核红细胞无绝对特异性抗体;且费用高,不易在临床推广。密度梯度离心法是根据细胞在体积,密度,沉降系数,渗透压等方面的不同设计的一种简单有效,较实用的富集和分离方法,适合国内实验条件,它能从孕妇外周血细胞中分出单个核细胞层（内含胎儿有核红细胞）,所得的单个核细胞悬液进一步纯化分离,可得到较高纯度的胎儿有核红细胞;而本实验采用显微操作仪挑取在形态上被识别的有核红细胞,所获得的有核红细胞纯度较其它方法更高,费用更低。将所获得的有核红细胞用于X连锁隐性遗传病（DMD）的胎儿产前诊断中,为无创伤性产前基因诊断提供可靠的实验依据和方法。目的:探索应用密度梯度分离法结合显微操作法分离孕妇外周血中胎儿有核红细胞在杜氏进行性肌营养不良症（DMD）胎儿进行无创伤性产前基因诊断的可行性。方法:取已生育过DMD患儿的孕妇（孕15～16周）外周血10ml,采用密度梯度离心法分离有核细胞层,滴片、瑞氏染色、显微镜下识别,并在显微操作仪下挑取胎儿有核红细胞,然后提取有核红细胞的DNA;同时提取孕妇、其丈夫及DMD患儿外周血的DNA。将胎儿有核红细胞的DNA先进行15N的随机引物预扩增,然后对预扩增产物以及外周血DNA的dystrophin基因中4个短串联重复序列多态位点片段（STR-44,STR-45,STR-49和STR-5,-DysII）进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,进行家系连锁分析。结果:1.光镜下根据有核红细胞的形态特点找到并挑取有核红细胞:家系1,8个;家系2,6个;家系3,7个。2.各家系的有核红细胞DNA经随机引物预扩增后的DNA量,可足够用于诊断。3.对三个家系的dystrophin基因进行连锁分析,准确检测出三例,其中男性患儿一例,正常女性一例,携带者一例。诊断的结果与用羊水进行产前诊断证实一致。结论:1.密度梯度离心分离法结合显微操作方法分离胎儿有核红细胞,能分离较高纯度的胎儿有核红细胞2.有核红细胞的DNA经随机引物预扩增能得到足够的模板量3.分离的胎儿有核红细胞可用于DMD遗传病的产前诊断。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 第2章 材料与方法
• 第3章 结果
• 第4章 讨论
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果