论文摘要
β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase,β-1,4-GT）是一种Ⅱ型膜结合糖蛋白,通常认为是一种管家基因产物,是至今研究最多的糖基转移酶之一。β-1,4-GT利用尿苷二磷酸半乳糖（UDP-galactose,UDP-Gal）作为激活的糖供体,把半乳糖转移到N-多糖复合物末端的N-乙酰基葡萄糖胺上。它不仅存在高尔基体上,而且整合于细胞质膜上,并表现不同的生物学功能。 巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间和胞内型蛋白质。该系统具有细胞繁殖快、培养条件廉价、遗传操作简单、易于工业化生产等原核表达系统的特点,又具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力,避免了包涵体变性、复性,及复性后产物活性低甚至无生物学活性等问题,非常有利于真核基因的表达。 本文采用降落PCR技术,以含有β-1,4-GT基因的pGEX-4T-2质粒为模板对β-1,4-GT基因进行克隆改造,测定了克隆获得的DNA片段,与已知的基因序列一致。将克隆获得基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和Not Ⅰ之间,构建了重组分泌表达质粒pPIC9K-GT。应用电穿孔法将线性化的重组表达质粒转入宿主感受态细胞GS115,经筛选获得β-1,4-GT多拷贝整合酵母工程菌Pochia pastoris GS115。在0.5%（v/v）甲醇诱导下,工程菌Pochia pastoris GS115成功分泌了β-1,4-GT。将SDS-PAGE蛋白电泳进行密度扫描,显示β-1,4-GT占总分泌蛋白的35%。用Sephadex G-75凝胶过滤来纯化分泌蛋白,最终得率为92mg/L。将在1分钟内能转化1nmol底物所需的酶量定义为一个酶活力单位。利用苯酚红会随H+浓度改变在557nm光密度值变化的特点,测定β-1,4-GT的酶活为98.6U,酶的比活力为21.43U/mg。同时对胞外分泌和胞内蛋白的酶活进行了比较。 我们的研究为日后对β-1,4-GT进行更广泛深入的研究,以及工业化生产有活性的β-1,4-GT奠定了基础。
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摘要Abstract第一篇：论文综述部分第一部分：β-1，4-半乳糖基转移酶的研究进展前言1、β-1，4-半乳糖基转移酶家族的发现与克隆2、两类β-1，4-半乳糖基转移酶的区别3、β-1，4-半乳糖基转移酶的蛋白分子结构4、β-1，4-半乳糖基转移酶的生物学功能参考文献第二部分：毕赤酵母外源基因表达系统的应用及研究进展前言1、毕赤酵母表达宿主菌2、毕赤酵母表达载体3、重组表达载体与毕赤酵母的转化及整合4、外源蛋白在其中的表达5、毕赤酵母表达系统与大肠杆菌表达系统的比较6、毕赤酵母表达系统的应用及研究进展参考文献第二篇：论文实验部分 β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及其活性的研究前言实验流程图：1.实验材料和仪器1.1 菌种1.2 质粒1.3 酶及蛋白制剂1.4 各种试剂盒1.5 其他试剂1.6 常用溶液及缓冲液1.7 培养液和固体培养基1.8 各种电泳胶的制备1.9 主要仪器2.实验方法2.1 引物的设计与合成2.2 β-1，4-GT基因克隆片段的制备2.3 改造后的β-1，4-GT基因片段的回收2.4 pUCm-GT的构建及鉴定2.5 测序及序列分析2.6 pPIC9K-GT表达质粒的构建及鉴定2.7 pPIC9K-GT表达工程菌的制备+表型重组酵母的诱导表达实验'>2.8 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验2.9 β-1，4-GT的纯化2.10 β-1，4-GT的活性测定2.11 胞外分泌及胞内保留的β-1，4-GT的酶活比较3.实验结果3.1 β-1，4-GT基因的改造和克隆3.2 阳性克隆的筛选及酶切鉴定3.3 Fe-SOD基因的序列及分析3.4 pPIC9K-GT质粒的构建3.5 pPIC9K-GT基因在毕赤酵母GS115中的表达3.6 β-1，4-GT的纯化3.7 β-1，4-GT的活性测定3.8 胞外分泌及胞内保留的β-1，4-GT的活性比较4.讨论4.1 重组质粒pPIC9K-GT线性化原因4.2 巴斯德毕赤酵母的转化方法的选择4.3 表达系统的选择4.4 毕赤酵母发酵培养基的选择4.5 活性测定5.总结参考文献附录一：（英文缩写词表）附录二：（质粒pPIC9K图谱）附录三：碱提取质粒方法附录四：LiCl转化法致谢
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β-1，4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及活性测定
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